大肠癌的差异蛋白质组学研究

陈艳

摘 要：文章通过初步观察大肠癌患者癌组织与正常成人肠黏膜蛋白质的差异表达，为进一步探讨大肠的分子机制奠定基础。应用蛋白质组学的双向电泳技术，对大肠癌患者与正常成人肠黏膜蛋白质表达进行比较，观察其差异点。得到分辨率和重复性均好的大肠癌患者与正常成人直肠黏膜蛋白的双向凝胶电泳图谱，发现二者之间在表达上有明显差异，差异表达蛋白质点数共26个差异点，其中在大肠癌组织中表达上调点11个，下调的点15个。共分析了10个差异蛋白点，在10个蛋白质点中有5个蛋白质点得到鉴定。结论是大肠癌原发灶和正常肠黏膜蛋白质组表达有显著差异，HSP27蛋白、S100A9蛋白和GST-π蛋白表达上调，GRP75蛋白表达下调有可能与大肠癌发生相关。

关键词： 大肠癌 蛋白质组学 差异表达

大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率呈上升趋势，尤其是结肠癌发病率的增长速度迅猛。全球大肠癌的发病率在肿瘤中男性居第4位、女性居第3位，患病率居第2位[1]。早期发现、早期诊断、早期治疗是决定大肠癌患者预后及生活质量的关键。为了深入研究大肠癌发生、发展的分子机制，强化大肠癌的防治效果，笔者采用蛋白质组学双向凝胶电泳（2-DE）等研究方法，对比分析正常直肠黏膜、大肠癌原发灶组织中蛋白质的表达差异，分离、鉴定大肠癌发生的相关蛋白，研究其对大肠癌细胞生物学行为的影响，以期为筛选临床肿瘤标志物和治疗靶标提供依据。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1标本采集。实验所用标本均取自湖南中医药大学第二附属医院，国家重点肛肠科经病理确诊的本病首诊患者共10例，以及经病理确诊的正常成人直肠黏膜12例。

1.1.2试剂。IPG缓冲液pH3～10、24cm固相化pH梯度干胶条、2D Quant蛋白质定量试剂盒、考马斯亮蓝G-250，购自Amershan Pharmacia公司。

1.1.3仪器。IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALT Ⅱ垂直电泳槽、Imagescanner扫描仪均为Amersham Biosciences公司产品。

1.2方法

1.2.1组织蛋白样品的制备。组织活检样本用生理盐水反复冲洗，以去除血液及其他污染，称取适量组织样品与8倍体积的组织裂解液混合后，用研钵使组织充分研磨裂解，研磨过程中不断加入液氮以避免蛋白降解，置于室温下1小时，间断涡旋混匀，然后于12000g、4℃离心1小时，吸取上清液即为组织的总蛋白质。2D Quant Kit定量试剂盒测定蛋白浓度。

1.2.2二维凝胶电泳。操作步骤主要按照IPGphor等电聚焦系统使用指南进行。实验重复3次。

1.2.3凝胶图像分析。应用Imagescanner扫描仪及LabScan扫描软件扫描考马斯亮蓝染胶获取图像，PDQuest 2-DE软件比较分析健康人和大肠癌患者组织蛋白二维电泳图谱的差异，选取表达水平相差 2倍以上的点作为后续质谱分析的候选蛋白质点。

1.2.4质谱分析。从胶中切取差异蛋白质点于1.5 ml Eppendorf管中，50%乙腈和100 mmol/L碳酸氢铵脱色30 min，乙腈脱水冷冻抽干。加入10 μl TPCK处理的胰蛋白酶（0.1 mg/L）冰上吸胀60 min，37℃酶解12 h，30 μl萃取液（100%乙腈∶5%甲酸1∶1）萃取60 min，重复萃取1次。将萃取液收集于0.5 ml Eppendorf管，冷冻浓缩至总体积2-5μl。制备好的样品在MALDI-TOF-MS质谱仪中进行分析仪上进行分析。结果利用Mascot软件检索NCBI数据库鉴定蛋白质。

2.结果

2.1两组组织二维电泳图谱的建立和图像分析

应用2-DE技术分别分离12例健康人直肠黏膜和10例大肠癌患者癌组织的混合蛋白。考马斯亮蓝G-250染色后，得到了健康人和大肠癌患者组织的2-DE图谱。为了保证结果的可靠性，在相同的条件下重复2-DE两次，获得两组的2-DE图谱各3张，采用PDquest图像分析软件对2-DE图像进行分析。结果显示：健康人组织平均蛋白质点数为1000±10，大肠癌组织平均蛋白质点数为1010±5，匹配率为（93.5±5.0）%。两种组织样本共有26个差异点，其中在大肠癌组织中表达上调点11个，下调的点15个。图1为有代表性的大肠癌组织蛋白质的2-DE图谱。

2.2差异蛋白质点的鉴定

从胶中切取较明显的10个差异蛋白质点，进行MALDI-TOF-MS质谱分析。利用Mascot查询NCBI数据库，如果Mascot分数>56分（P<0.05）则认为得到鉴定，否则视为未得到鉴定。在10个蛋白质点中有5个蛋白质点得到鉴定，即HSP27蛋白，S100A9蛋白，GST-π蛋白，GRP75蛋白，Aldehyde dehydrogenase X蛋白。

3.讨论

不同生物学特性的肿瘤细胞具有不同的发生、发展和特殊性状，其中蛋白表达的差异起到了重要作用。肿瘤与正常组织或细胞的蛋白质表达谱差异分析是肿瘤蛋白质组学研究中应用最广泛和最有效的手段[2，3]。本课题利用蛋白组学技术比较了大肠癌组织与正常直肠黏膜，发现了5种蛋白质的表达水平均发生了明显变化，这些差异表达的蛋白有可能成为早期诊断大肠癌的候选标记物。本研究鉴定出的HSP27、Sl00A9和GST-π均可能与大肠癌的发生有关，可能作为大肠癌早期诊断的候选新型生物标志物及大肠癌治疗的靶标，但这需要在以后的实验中进一步证实。生物信息学分析表明，本研究筛选出的5种蛋白与细胞增殖、信号转导通路、细胞周期调控等密切相关，可能在大肠癌的发生发展中起重要作用，而对这些蛋白的特性功能进一步分析研究可为探讨大肠癌的分子机制、寻找大肠癌早期诊断的分子标记物提供实验和理论依据。

参考文献：

[1]Park in DM，Bray F，Ferlay J，et al.G lobal cancer statistics[J].CA CancerJ Clin，2005，55（2）：74-108.

[2]Lawrie LC，Fothergill JE，Murray GI.Spot the differences：proteomics in cancer research.Lancet Oncol，2010，2（11）：698.

[3]Simpson RJ，Dorow DS.Cancer proteomics：from signaling networks to tumor markers.Trends Biotechnol，2010，19（10 Suppl）：40.