蛋白质棕榈酰化修饰的分析方法进展

2014-10-24方彩云张晓勤陆豪杰

分析化学 2014年4期

关键词：评述

方彩云　张晓勤　陆豪杰

摘要：棕榈酰化修饰是蛋白质翻译后脂质修饰的重要形式之一，在细胞信号传导、代谢、凋亡、疾病的发生、发展等过程中都起着重要的作用。因此，定性和定量分析蛋白质棕榈酰化修饰对理解其生物学功能具有重要意义。本文综述了近年出现的蛋白质棕榈酰化修饰分析技术和方法及其优缺点，并对其未来的发展趋势进行了展望。

关键词：棕榈酰化修饰；质谱技术；蛋白质组学；评述

1引言

蛋白质翻译后修饰的发生使得蛋白质的结构更复杂、功能更完善，在生物体内起着极为重要的作用，脂类修饰便是其中一种非常重要的翻译后修饰形式。棕榈酸盐是丰度最高的脂肪酸，可被共价修饰到蛋白质上。根据连接方式不同，棕榈酰化修饰可分为N型（通过酰胺键连接到Gly/Cys残基上）和S型。蛋白质的S型棕榈酰化修饰（Palmitoylation）是指饱和的16个碳的棕榈酸盐通过硫酯键共价修饰到蛋白质Cys的巯基上[1]，如图1所示），它是一种动态、可逆的翻译后修饰形式，可在时间和空间上调节蛋白质的功能。许多棕榈酰化修饰的可溶或整合膜蛋白质，如信号蛋白质（包括在癌症和突触信号中断关键因子）、细胞黏附分子和神经递质受体等，可调控蛋白质的活性和稳定性，蛋白蛋白相互作用，促进蛋白质定位膜脂筏等，在细胞信号传导、代谢、凋亡、疾病的发生和癌变中都起着重要的作用[1，2]。

深入研究和理解蛋白质棕榈酰化修饰的机制，定性和定量分析含这种修饰的蛋白质，以及对棕榈酰化和去棕榈酰化修饰相关酶的理解、动态监控棕榈酰化和去棕榈酰化的周期，对理解复杂信号通路的空间和时间调节等都具有重要意义。定点突变法是传统的方法。一般是将候选的半胱氨酸Cys残基突变为Ser或Ala，将突变体克隆和野生型分别转染细胞，并比较两者的功能差异。但这种方法不能直接检测内源蛋白质，棕榈酰化修饰位点的突变可能会导致附近的Cys残基发生异常[3]。此外，许多蛋白质棕榈酰化抑制剂及去棕榈酰化的棕榈酰硫脂酶也被广泛使用，例如，2溴软脂酸乙烯（2Bromopalmitate， 2BP）[4]，浅蓝菌素（Cerulenin）和衣霉素（Tunicamycin）等都具有较好的效果[5]。尽管这些方法的应用促进了人们对蛋白质棕酰化修饰的认识，但在没有任何修饰位点信息提示的情况下，这样的研究过程不但耗时费力，而且棕榈酰化修饰位点的鉴定比较困难。这是因为：（1）虽然已知一些蛋白质酰基转移酶在富含半胱氨酸的结构域中有保守的DHHC motif，且也已发现几种去酰化酶，但蛋白质发生S棕榈酰化修饰和去棕榈酰化修饰的酶学尚不清楚[6]；（2）还没有明确的蛋白质棕榈酰化修饰的共识基序（Consensus motif）[7]；（3）棕榈酰化修饰通常发生在跨膜蛋白或膜相关的蛋白质[8]，而膜蛋白的溶解度和丰度低，长链脂肪酸的加入更进一步增加了其疏水性，增加了检测难度；（4）不像磷酸化和糖基化修饰，它没有亲和基团如棕榈酰化修饰特异的抗体等用于富集低丰度的棕榈酰化修饰蛋白质。因此，人们对它的认识远不及糖基化、磷酸化等其它翻译后修饰。

目前，随着质谱和组学技术的发展，越来越多的棕榈酰化修饰蛋白质及其修饰位点得到了鉴定，极大地促进了人们对蛋白质棕榈酰化修饰的理解。为此，本文就基于质谱和组学手段的棕榈酰化修饰蛋白质/肽段的分析方法及其进展进行了综述。

2生物信息学预测方法

3质谱法直接检测蛋白质的棕榈酰化修饰位点和脂质基团

质谱分析具有灵敏度高、样品用量少等优点，能准确分析连接到酰化修饰蛋白质甚至是单一酰化修饰位点上的脂肪酸种类。一般是通过层析或免疫沉淀等方法获得目标蛋白质，根据序列的特性选择合适的酶进行蛋白质酶解后，然后比较羟胺处理前后相应酶解肽段的质量会发生变化，从而可通过质谱方法鉴定该酰化修饰基团的分子特性[14]。Hemagglutinin（HA）是一个主要的包膜糖蛋白调节病毒和细胞膜融合，通过含有一个跨膜域和一个胞质尾的轻HA2链锚定在病毒包膜上，C末端区域的3个Cys残基（一个在跨膜域，两个在胞质尾）是高度保守，且在所有HA亚型中都可能棕榈酰化。Kordyukova等[15]用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDITOF MS）分析流感病毒蛋白HA上脂肪酸的类型时发现，具有两个胞质Cys的Influenza B virus HA含有棕榈酰化修饰，具有一个跨膜Cys的Influenza C virus HA发生了硬脂酸酰化修饰，而有一个跨膜和两个胞质Cys的Influenza A virus HA则同时包含棕榈酸盐和硬脂酸酰化修饰。Serebryakova等[16]用MALDITOF MS分析A/X31（H3 subtype），A/Puerto Rico/8/34 （H1 subtype）和A/FPV/Weybridge/34 （H7 subtype）病毒中C末端HA2肽段时，发现这些肽段不仅能被棕榈酸盐修饰，还能被硬脂酸修饰，且3株病毒中棕榈酸/硬脂酸的比例不同，其中A/FPV/Weybridge/34病毒株优先结合硬脂酸。Ozols等[17]用溴化氰裂解、Trysin和LysC酶解纯化的含[3H]palmitate标记的αTubulin后进行质谱分析发现，与C20， C213和C305相比，C376是主要的棕榈酰化修饰位点。Bizzozero等[18]发现棕榈酰化是天然髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP）的主要翻译后修饰类型，且在中枢神经系统中大多数的PLP和DM20是完全酰化的。

气相色谱质谱联用（GCMS）被广泛用于复杂组分的分离与鉴定，其具有GC的高分辨率和MS的高灵敏度，适于低分子化合物尤其是挥发性成分的分析。Sorek等用GCMS分析了蛋白质AtROP6[19]和CBL1[20]上的脂质基团；在氧化铂（Ⅳ）存在下，通过氢化反应将S棕榈酰化修饰蛋白质的巯酯键打断，释放蛋白质上的脂肪酸基团并用纯甲酸和乙醇产生乙基酯化后，用GCMS分析了蛋白质的S棕榈酰化修饰，该法能分析低至1 μg的纯化蛋白质，并可实现S棕榈酰化水平的相对定量[21]，他们认为，通过氢化反应并结合乙基酯化可得到极性基团的脂肪酸，提高GC的分离和鉴定。体外转移甲基和稳定同位素标记法（iFAT）结合GCMS方法可定量比较不同细胞状态下的酰基修饰[22]，iFAT法适于处理疏水性的膜蛋白质，通过数据库检索和标准脂肪酸甲酯的色谱保留时间可实现酰基的鉴定，稳定同位素标记可用作内标准确比较不同细胞状态下酰基修饰。

但许多棕榈酰化修饰的蛋白质是膜蛋白，疏水性较强，不容易得到纯化的蛋白质样品，这在一定程度上限制该方法的应用。

4以“棕榈酸盐为中心”的分析方法

4.1放射性棕榈酸盐代谢标记法

最经典的方法是用放射性棕榈酸盐（例如，3Hpalmitate和125Ipalmitate）代谢标记培养细胞，通过放射自显影检测同位素标记的程度，检测棕榈酰化修饰的蛋白质，其中，3Hpalmitate是使用最广泛的放射性标记棕榈酸盐[23]。但该法操作繁琐、需很长的曝光时间；使用较高浓度的放射性同位素，有害且处理费用高；只能用于检测活细胞中的棕榈酰化修饰蛋白质；产生的信号弱，灵敏度不高，不能检测丰度较低的棕榈酰化修饰蛋白质；无法提供棕榈酰化修饰的化学计量信息，且缺乏直接富集和鉴定放射性标记蛋白质的方法。

4.2棕榈酸脂类似物代谢标记法

叠氮或炔基脂肪酸探针非常灵敏，为快速检测和富集细胞脂质修饰蛋白质提供了机会。由于含叠氮或炔基的棕榈酸类似物从结构和功能上来说都与它们的天然产物相似，因此能通过代谢通路进入到细胞蛋白质中。将含叠氮或炔基的棕榈酸类似物代谢进入细胞蛋白质，然后通过化学选择性链接如施陶丁格连接[24]或点击化学[25]方法，选择性地将带叠氮或炔基基团的蛋白质连接到生物素或荧光基团上，从而富集或检测棕榈酰化修饰的蛋白质。与放射性棕榈酸盐代谢标记方法相比，该法不使用放射性同位素，检测时间较短，荧光基团的使用大大提高了方法的灵敏度，可通过亲和纯化富集或利用荧光探针观察棕榈酰化修饰蛋白质。

4.2.2以炔基为化学报告基团的方法虽然叠氮基脂肪酸类似物在检测蛋白质脂肪酸酰化修饰方面取得了很大的进展，但添加一个叠氮基团到脂肪酸链上，可能会干扰脂肪酸的疏水性及其进入脂质膜结构的机制。而炔基可保留脂肪酸碳链的疏水性，减少脂肪酸物理化学性质的变化及其与脂质间的相互作用，且具有代谢惰性（图2）。另外，通过点击化学捕获比施陶丁格连接的效率要高，因此炔基探针通常要优于叠氮修饰的探针，具有更高的灵敏度和检测效率[30]。利用基团荧光检测方法可提供研究动态复杂的生物过程的手段[31]，定量荧光显微镜方法能用来研究活细胞内GFPtagged棕榈酰化蛋白质的胞内定位和运输[32，33]。因此，Hannoush等[34]将一系列不同碳链长度的ω炔基脂肪酸加到哺乳动物细胞系中，通过加成反应将目标蛋白质连接到带叠氮基团的生物素或荧光基团上，然后利用链霉亲和素连接的辣根过氧化物酶进行免疫印迹分析，并通过高分辨的共聚焦显微镜分析了含ω炔基脂肪酸蛋白质的亚细胞分布以及脂质修饰蛋白质在细胞分化不同阶段的分布情况。Zhang等[35]利用串联标记和检测的方法同时监控动态的S棕榈酰化修饰和蛋白质的更新，他们同时用两种不同的化学报告基团进行代谢标记，一种用于检测动态的S棕榈酰化修饰，另一个则用来监控蛋白质的周转率，随后用正交荧光标签依次地进行点击化学反应，从而有效地分析细胞中棕榈酸盐的循环周期。他们也发现，较短的脂肪酸类似物（az12和alk12）优先标记Nmyristoylated蛋白质，而较长的脂肪酸衍生物（az15和alk16））则会进入S棕榈酰化修饰的蛋白质中[36]。Yount等[37]用alk16[38]为化学报告基团，分析了鼠树突状细胞系中棕榈酰化修饰蛋白质组，共鉴定到157个具有不同细胞功能的脂质修饰蛋白质（其中60个和97个被分别为高可信度和中可信度），他们的研究发现，IFITM3的抗病毒活性受到S棕榈酰化修饰的调控。Yap等[39]将ω炔基棕榈酸盐类似物代谢进入GAPDH或线粒体3羟基3甲基戊二酰基CoA合成酶，通过点击化学与叠氮的生物素探针或荧光探针3azido7hydroxycoumarin反应快速检测棕榈酰化修饰。Martin等[40]用商品化的17Octadecynoic acid （17ODYA）作为生物正交、点击化学探针进行原位标记，从永生的Jurkat T细胞中共鉴定了125个高可信度和大约200个中间可信度的棕榈酰化修饰蛋白质，包括G蛋白、受体和一些质膜定位依赖于棕榈酰化修饰的水解酶等。这是首个哺乳动物细胞棕榈酰化蛋白质组的分析。随后，又将17ODYA代谢标记和SILAC（Stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture）法相结合，在小鼠T细胞杂交瘤细胞中定性和定量了400多个棕榈酰化修饰蛋白质，并用17ODYA代谢脉冲追踪标记方法分辨稳定的和更新较快的棕榈酰化修饰蛋白质[41]。

综上，虽然“以棕榈酸盐为中心”方法有其优点，但也存在不足之处：需将放射性或化学修饰的棕榈酸脂类似物代谢标记到细胞内，故不能分析组织样品和体液，且较难用于癌细胞，因为癌细胞中脂肪酸合成酶的过度表达和过度活跃会极大地降低外源性长链脂肪酸的摄入[42]；与相对稳定的棕榈酰化修饰蛋白质相比，该法可能会更加偏向棕榈酸盐更新较快的蛋白质；只能分析特定的S酰化修饰，若引入棕榈酸脂类似物，则只能分析棕榈酰化修饰，不能分析其它更短、更长或不饱和脂肪酸修饰的蛋白质；来自于天然脂肪酸和放射性标记的脂肪酸类似物之间的结构差异带来的生理影响还不清楚，真核细胞中代谢途径非常复杂，棕榈酸脂类似物可能会以不同的代谢途径进入，导致无法预测的生物学效应。

ABE法的优点是不需代谢标记，可分析细胞（包括癌细胞）、组织和体液样品，尽管在检测棕榈酰化修饰蛋白质方面有了很大的进展，但也有如下的局限性：（1）假阳性率相对较高：该法是巯酯键特异的方法而不是S棕榈酰化修饰特异的方法，外源性的羟胺水解敏感的巯酯键蛋白质都可能被同时富集而造成假阳性。实际操作时，首先要确保蛋白质中原先存在的自由巯基完全封闭，需严格控制自由巯基封闭试剂的种类、用量和孵育时间等；需控制反应时间、羟胺的浓度和溶液的pH值，保证羟胺完全切除棕榈酰化修饰基团；去除棕榈酰化修饰基团后，应完全标记新产生的自由巯基；用链霉亲和素磁珠富集时，也可能会将体内生物素化修饰蛋白质富集而造成固有背景，以上这些因素会导致近三分之一的鉴定蛋白质为假阳性结果[8， 54]。与ABE方法相比，点击化学具有明显较低的假阳性率[55]。因此，为减少假阳性结果，一般需进行对照实验。（2）该法为间接检测和纯化方法，用该法得到的蛋白质可能是棕榈酸修饰的蛋白质，也可能是对羟胺水解敏感的其它脂肪酸修饰的蛋白质，若需准确鉴定连接到蛋白质上的脂质类型，则需采用GCMS进一步分析。

6展望

由于缺乏明确的蛋白质棕榈酰化修饰位点，极大地阻碍了棕榈酰化修饰蛋白质功能的研究。尽管近年来已受到越来越多的重视，并取得了较大的进展，尤其是ABE法和棕榈酸盐类似物代谢标记方法的发展，使越来越多的棕榈酰化修饰位点得到了鉴定，但目前关于棕榈酰化修饰蛋白质组研究的报道主要集中于位点的鉴定，即定性研究，且现有方法也都各有其不足之处，因此，仍需致力于棕榈酰化修饰蛋白质定性与定量分析，发展更有效及准确特异的研究方法，比如，由于棕榈酰化修饰蛋白质为细胞膜蛋白或者是与膜相关的蛋白质，疏水性强，因此可结合细胞膜蛋白质组学方法，增加膜蛋白的溶解性；现有分析方法操作步骤多，易造成样品损失尤其是低丰度蛋白质的损失，且鉴定结果的假阳性率高，因此可适当简化操作流程，选用合适的去垢剂，采用选择性好、富集效率高的新型富集载体，甚至是选用能同时满足富集和定量分析要求的富集材料，并建立相应的分析方法；发展灵敏度高、选择性好的荧光检测试剂；发展一些代谢效率更高的脂肪酸类似物等，从而提高样品分析的重复性、灵敏度和定量的准确性，以获得更多可靠的棕榈酰化修饰蛋白质及其位点的信息，甚至与活细胞成像等方法相结合，从而有助于进一步揭示动态S棕榈酰化修饰的生物重要性和功能。

References

1Fukata Y， Fukata M. Nat. Rev. Neurosci.， 2010， 11（3）： 161-175

2Stoeck A， Shang L， Dempsey P J. J. Cell Sci.， 2010， 123（Pt 13）： 2319-2331

3Abrami L， Leppla S H， van der Goot F G. J. Cell Biol.， 2006， 172（2）： 309-320

4Maria P P， Aldo A V， Vanesa M T， Rafael G O， Guillermo A G， Jose L D. PLOS ONE， 2013， 8（10）： e75232

5DeJesus G， Bizzozero O A. Neurochem. Res.， 2002， 27（12）： 1669-1675

6Zeidman R， Jackson C S， Magee A I. Mol. Membr. Biol.， 2009， 26（1）： 32-41

7Smotrys J E， Linder M E. Annu. Rev. Biochem.， 2004， 73： 559-587

8Roth A F， Wan J， Bailey A O， Sun B， Kuchar J A， Green W N， Phinney B S， Yates JR 3rd， Davis N G. Cell， 2006， 125（5）： 1003-1013

9Zhou F， Xue Y， Yao X， Xu Y. Bioinformatics， 2006， 22（7）： 894-896

10Ren J， Wen L， Gao X， Jin C， Xue Y， Yao X. Protein Eng. Des. Sel.， 2008， 21（11）： 639-644

11Xue Y， Chen H， Jin C， Sun Z， Yao X. BMC Bioinformatics， 2006， 7： 458

12Wang X B， Wu L Y， Wang Y C， Deng N Y. Protein Eng. Des. Sel.， 2009， 22（11）： 707-712

13Li Y X， Shao Y H， Deng N Y. Protein Peptide Lett.， 2011， 18（2）： 186-193

14Liang X， Lu Y， Neubert T A， Resh M D. J. Biol. Chem.， 2002， 277（36）： 33032-33040

15Kordyukova L V， Serebryakova M V， Baratova L A， Veit M. J. Virol.， 2008， 82（18）： 9288-9292

16Serebryakova M V， Kordyukova L V， Baratova L A， Markushin S G. Eur. J. Mass Spectrom.， 2006， 12（1）： 51-62

17Ozols J， Caron J M. Mol. Biol. Cell， 1997， 8（4）： 637-645

18Bizzozero O A， Malkoski S P， Mobarak C， Bixler H A， Evans J E. J. Neurochem.， 2002， 81（3）： 636-645

19Sorek N， Poraty L， Sternberg H， Bar E， Lewinsohn E， Yalovsky S. Mol. Cell Biol.， 2007， 27（6）： 2144-2154

20Batistic O， Sorek N， Schultke S， Yalovsky S， Kudla J. Plant Cell， 2008， 20（5）： 1346-1362

21Sorek N， Yalovsky S. Nat. Protoc.， 2010， 5（5）： 842-848

22Li J， Yue Y， Hu X， Zhong H. Anal. Chem.， 2009， 81（12）： 5080-5087

23Resh M D. Methods， 2006， 40（2）： 191-197

24Saxon E， Bertozzi C R. Science， 2000， 287（5460）： 2007-2010

25Kolb H C， Finn M G， Sharpless K B. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.， 2001， 40（11）： 2004-2021

26Hang H C， Geutjes E J， Grotenbreg G， Pollington A M， Bijlmakers M J， Ploegh H L. J. Am. Chem. Soc.， 2007， 129（10）： 2744-2745

27Kostiuk M A， Corvi M M， Keller B O， Plummer G， Prescher J A， Hangauer M J， Bertozzi C R， Rajaiah G， Falck J R， Berthiaume L G. FASEB J.， 2008， 22（3）： 721-732

28Ching W， Hang H C， Nusse R. J. Biol. Chem.， 2008， 283 （25）： 17092-17098

29Martin D D， Vilas G L， Prescher J A， Rajaiah G， Falck J R， Bertozzi C R， Berthiaume L G. FASEB J.， 2008， 22（3）： 797-806

30Agard N J， Baskin J M， Prescher J A， Lo A， Bertozzi C R. ACS Chem. Biol.， 2006， 1（10）： 644-648

31Mikic I， Planey S， Zhang J， Ceballos C， Seron T， von Massenbach B， Watson R， Callaway S， McDonough P M， Price J H， Hunter E， Zacharias D. Methods Enzymol.， 2006， 414： 150-187

32Kenworthy A K. Methods， 2006， 40（2）： 198-205

33Kanaani J， Patterson G， Schaufele F， LippincottSchwartz J， Baekkeskov S. J. Cell Sci.， 2008， 121（Pt 4）： 437-449

34Hannoush R N， ArenasRamirez N. ACS Chem. Biol.， 2009， 4（7）： 581-587

35Zhang M M， Tsou L K， Charron G， Raghavan A S， Hang H C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2010， 107（19）： 8627-8632

36Charron G， Wilson J， Hang H C. Curr. Opin. Chem. Biol.， 2009， 13（4）： 382-391

37Yount J S， Moltedo B， Yang Y Y， Charron G， López C B， Hang H C. Nat. Chem. Biol.， 2010， 6（8）： 610-614

38Charron G， Zhang M M， Yount J S， Wilson J， Raghavan A S， Shamir E， Hang H C. J. Am. Chem. Soc.， 2009， 131（13）： 4967-4975

39Yap M C， Kostiuk M A， Martin D D， Perinpanayagam M A， Hak P G， Siddam A， Majjigapu J R， Rajaiah G， Keller B O， Prescher J A， Wu P， Bertozzi C R， Falck J R， Berthiaume L G. J. Lipid Res.， 2010， 51（6）： 1566-1580

40Martin B R， Cravatt B F. Nat. Methods， 2009， 6（2）： 135-138

41Martin B R， Wang C， Adibekian A， Tully S E， Cravatt B F. Nat. Methods， 2012， 9（1）： 84-89

42Menendez J A， Colomer R， Lupu R. Med. Hypotheses， 2005， 64（2）： 342-349

43Drisdel R C， Green W N. Biotechniques， 2004， 36（2）： 276-285

44Drisdel R C， Manzana E， Green W N. J. Neurosci.， 2004， 24（46）： 10502-10510

45Drisdel R C， Alexander J K， Sayeed A， Green W N. Methods， 2006， 40（2）： 127-134

46Wan J， Roth A F， Bailey A O， Davis N G. Nat. Protoc.， 2007， 2（7）： 1573-1584

47Zhao Z， Hou J， Xie Z， Deng J， Wang X， Chen D， Yang F， Gong W. Protein J.， 2010， 29（8）： 531-537

48Hemsley P A， Taylor L， Grierson C S. Plant Methods， 2008， 4： 2

49Kang R， Wan J， Arstikaitis P， Takahashi H， Huang K， Bailey A O， Thompson J X， Roth A F， Drisdel R C， Mastro R， Green W N， Yates JR 3rd， Davis N G， ElHusseini A. Nature， 2008， 456（7224）： 904-909

50Yang W， Di Vizio D， Kirchner M， Steen H， Freeman M R. Mol. Cell. Proteomics， 2010， 9（1）： 54-70

51Emmer B T， Nakayasu E S， Souther C， Choi H， Sobreira T J， Epting C L， Nesvizhskii A I， Almeida I C， Engman D M. Eukaryot. Cell， 2011， 10（3）： 455-463

52Zhang J， Planey S L， Ceballos C， Stevens S M Jr， Keay S K， Zacharias D A. Mol. Cell. Proteomics， 2008， 7（7）： 1378-1388

53Forrester M T， Hess D T， Thompson J W， Hultman R， Moseley M A， Stamler J S， Casey P J. J. Lipid Res.， 2011， 52（2）： 393-398

54Roth A F， Wan J， Green W N， Yates J R， Davis N G. Methods， 2006， 40（2）： 135-142