安络小皮伞菌糖肽理化性质与镇痛作用

高 阳,杨献玲,徐多多

(1.长春中医药大学研发中心,长春 130117;2.吉林省食品药品检验所,长春 130021)

安络小皮伞(Marasmius and rosaceus)俗称鬼毛针，是一种真菌，属担子菌纲、伞菌目、白蘑科小皮伞属。也是一种用于治疗多种疼痛的中药,商品名称为安络痛。研究[1-3]表明，其镇痛作用为有机酸和甾醇类化合物[1-3]。笔者对其有效部位进行了筛选，发现其水提醇沉淀物具有长时效镇痛作用，并对该有效部位进行分离、纯化，通过甲基化等方法，研究其理化性质和化学结构，确定其镇痛作用的物质基础，为安络小皮伞菌的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 安络小皮伞菌丝体发酵物由吉林省新华药业提供。DEAE-Sephadex A-50，Sephadex G-100，标准单糖Fuc(岩藻糖)、Rha(鼠李糖)、Ara(阿拉伯糖)、Xyl(木糖)、Man(甘露糖)、Gal(半乳糖)、Glu(葡萄糖)、葡萄糖醛酸(GlcA)、牛血清蛋白均为Sigma公司产品。其余试剂均为国产分析纯。蛋白质测定用试剂甲、乙为本实验室配制。大孔吸附树脂D101为天津大学生产。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 安络小皮伞菌丝体发酵物加5倍量水溶解，离心，重复此操作4次,残渣干燥(R)，上清液合并，浓缩至小体积，加95%乙醇至醇浓度达到80%，静止过夜，离心,沉淀冷冻干燥(样品P)，上清液回收乙醇，得到醇溶性小分子部分(S)。

1.2.2 理化性质的分析 样品总糖、蛋白质、糖醛酸含量测定分别以葡萄糖为标准品,以苯酚硫酸法测定总糖含量[4]；以牛血清白蛋白为标准品，用Lowry法测定蛋白质含量[5]；以葡萄糖醛酸为标准品，间羟基联苯法测定糖醛酸含量[6]。分子量分布采用高效液相色谱法进行测定[4]。

1.2.3 对醋酸导致小鼠扭体的抑制作用实验 昆明种小鼠(清洁级)，购自吉林大学,合格证号为SCXK(吉)2008-0005，体质量18～22 g，雌雄兼用，随机分组。样品以水溶解后各组小鼠每天灌胃给药1次，模型对照组给与等体积的水，连续10 d，正常进食。末次给药1 h后，每只小鼠腹腔注射0.6%的醋酸，观察小鼠20 min内的扭体次数。

1.2.4 大孔树脂柱层析 样品P以水溶解，离心后上样，分别以水(D1)、30%乙醇(D2)、60%乙醇(D3)、95%乙醇(D4)洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩后分别冷冻干燥得到D1、2、3、4等4个部分。

1.2.5 D2部分的纯化 样品D2 200 mg，以水溶解后在Sephadex G-100凝胶色谱柱(60 cm×4 cm)进行柱层析。每6 mL为1个流分收集洗脱液，测定其中的糖(酚-硫酸法)和蛋白质(UV 280 nm)含量，对洗脱流份作图，根据洗脱曲线合并12-25管(D2H)和26-58管(D2L)，冻干，得到纯化糖肽。

1.2.6 纯化样品的结构分析[8]采用Hakomori法(箱守法)，利用GC-MS检测：HP-5石英毛细管柱为30 mm×0.25 mm，进样口温度250 ℃。柱温120 ℃保持5 min，5 ℃/min升到220 ℃，在220 ℃保持20 min。进样量为0.2 μL。采用美国FINGAN公司的Xcalibur数据处理系统。红外光谱在Spectrum红外光谱仪测定。

2 结果

2.1 糖蛋白部分的提取和性质分析 安络小皮伞菌丝体粗糖肽中的糖部分是由葡萄糖和甘露糖组成,摩尔比为1∶9.2。氨基酸分析结果表明，其中含有10种氨基酸(在样品中的百分含量)Glu(6.12%)，Asp(10.10%)，Hyp(2.19%)，Ser(3.46%)，Arg(2.01%)，Gly(3.02%)，Thr(0.30%)，Pro(1.33%)，Leu(2.21%)and Lys(0.67%)。

2.2 糖蛋白的分离和理化性质分析 见表1。

表1 不同糖蛋白理化性质分析结果

2.3 对醋酸导致小鼠扭体的抑制作用实验 见表2。

2.4 糖蛋白的纯化和糖苷键分析 见表3。

表2 各样品对乙酸导致小鼠扭体反应的影响(n=10)

表3 D2H和D2L中糖苷键连接方式

3 讨论

镇痛实验结果表明，安络小皮伞菌丝体中分离得到的糖蛋白类成分具有镇痛作用，该部分含量占菌丝体的20%以上，是其镇痛作用的药效物质基础。分离得到的样品P为组成复杂的糖蛋白，经过大孔树脂分离后，得到的各样品糖和肽的含量有所不同，组成糖相同但其摩尔比例不同；表明安络小皮伞糖肽中多种糖肽具有镇痛作用；通过凝胶柱层析分离得到的纯化糖肽-D2H和D2L具有明显的镇痛作用，进而证明糖肽类成分是安络小皮伞镇痛作用的有效成分。对纯化糖肽的糖部分进行的分析表明，该糖蛋白中糖的部分无论分子量大小，均是由1-4连接Glc为主链,在其6位连接由Glc、Man和Gal构成的侧链；肽部分是由10种氨基酸组成；该镇痛作用可能来自这些糖肽均具有的共性结构部分。

[1]戴芳澜.中国真菌总汇[M].北京:科学出版社,1979:532-534.

[2]方圣鼎,张振德,陈嫌,等.安络小皮伞中的镇痛成分[J].中草药,1989,20(10):2-4.

[3]陈西广,张翼伸.安络小皮伞中水溶性多糖的研究[J].真菌学报,1990(2):155-160.

[4]张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].2版.杭州:浙江大学出版社,2003:1-259.

[5]李建武,萧能庚,余瑞元.生物化学实验原理方法[M].北京:北京大学出版社,1994.