近红外光谱技术测定小麦过氧化氢酶的研究

黄亚伟，王春华，王若兰

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

0 引言

过氧化氢酶（CAT）是生物防御体系的关键酶之一[1].CAT 普遍存在于植物体组织与细胞中，是最早发现与种子活力有关的氧化酶之一[2].CAT 具有提高植物光合作用、增强植物防御能力和延缓衰老等作用[3]，其含量可以间接反映种子活力的大小.因此，CAT 的含量是评判小麦籽粒新鲜度的一个重要指标.传统测定方法是用已知浓度的高锰酸钾溶液来定量测定体系中的过氧化氢，从而确定酶的量[4].通过实际应用，发现其操作繁琐、费时，对pH 值非常敏感，不是一种理想的检测方法[5].

近红外光谱是一种高效、快速的现代分析技术.目前，其已成为小麦、水稻、玉米等农作物品质分析的重要手段[6]，与化学分析相比，近红外光谱技术是一种无损、绿色、快速的分析方法.本文以河南省不同地区中不同储藏年限的小麦为样本，建立小麦过氧化氢酶含量的近红外光谱预测模型，开发出一种小麦过氧化氢酶含量的快速测定方法，实现对储藏小麦及种子粮新鲜度的快速筛查.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从河南省不同地区收集储藏1～4 a 的小麦125 份.

30%过氧化氢溶液、高锰酸钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、98%硫酸等均为分析纯.

1.2 主要仪器

HY-2 调速多用振荡器：金坛市杰瑞尔电器有限公司；PL203 电子天平：梅特勒－托利多仪器上海有限公司；101-2 型电热鼓风恒温干燥箱：上海浦鸿仪器厂；JXFM110 锤式旋风磨：上海赛霸精密仪器有限公司；FOSS Infratec 1241 近红外谷物分析仪：丹麦福斯公司.

1.3 方法

1.3.1 样品制备

除去小麦样品的秸秆、土块等杂质后，混合均匀置于自封袋内，放于冰箱中备用.

1.3.2 化学值的测定

水分的测定：按GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》中的直接干燥法.

过氧化氢酶活性的测定：按GB/T 5522—2008.

1.3.3 近红外光谱数据的采集

光谱仪开机后先预热大约30 min，然后取小麦籽粒，倒在光谱仪样品传送带上，进行扫描.光谱采集条件为：扫描范围为570～1 098 nm，光谱间隔点为2 nm.每个样品重复扫描2 次取平均值，以克服样品的不均匀性.小麦样品的近红外光谱如图1 所示.

1.4 近红外光谱数学模型的建立

利用仪器自带WINISI 定标分析软件建立小麦过氧化氢酶含量的检测模型，并对影响模型结果的条件（光谱散射处理、数学处理参数）进行考察，选择最优的建模参数.

1.5 模型的验证

模型采用内部交叉验证和外部验证两种方法.内部交叉验证是依次剔除建模样品组中一个或多个样品，用剩余样品来建模预测被剔除的样品，比较被剔除样品预测值与测定值的差异，由此判断模型的预测准确性；外部验证是选择一批与建模样品集独立无关的样品，通过比较独立样品预测值与实际分析值的差异来判断模型的预测准确性.

2 结果与分析

2.1 样品集的选择

将样品按照建模集与预测集3∶1 的比例，并按过氧化氢酶由小到大排列，然后从中选取定标集和预测集.对125 份样品进行分集，过氧化氢酶活性的分布情况如表1 所示，同时保证测量值的最大值和最小值归为建模集.

表1 定标集和预测集样品中过氧化氢酶的分布

由表1 可知，样品的过氧化氢酶范围分布较广，其中最小值为6.0 mg/g，最大值为151.0 mg/g，过氧化氢酶的梯度分布较均匀，基本覆盖当前河南小麦品种，所选样品符合近红外建模要求.

2.2 建模参数的选择

2.2.1 数学处理方法的选择

衡量模型质量的主要参数有：定标标准偏差（SEC）、定标相关系数（RSQ）、交叉验证标准偏差（SECV）和交叉验证相关系数（1-VR）.在选择最佳定标参数时，采用软件默认的光谱预处理方式，即去散射处理方式采用SNV and Detrend，回归分析采用Modified PLS，对不同的数学处理方法进行比较，如表2 所示.

表2 不同数学处理方法得到的过氧化氢酶定标参数

利用RSQ 来衡量模型的优劣，即RSQ 越大，定标效果越好.从表2 可知，数学预处理方法选择“2，1，1，1”时结果最优.

2.2.2 散射校正方法的选择

选用表2 中最优数学处理方法，回归分析采用Modified PLS，比较无散射处理（None）、标准正常化结合去散射处理（SNV and Detrend）、标准正常化处理（SNV only）、去散射处理（Detrend only）、标准化多元散射校正（Standard MSC）、重力多元离散校正（Weight MSC）、反相多元离散校正（Inverse MSC）等7 种散射处理的定标参数.不同散射校正处理方法得到的过氧化氢酶定标参数，如表3 所示.

表3 不同散射校正处理方法得到的过氧化氢酶定标参数

由表3 可知，采用不同散射处理会产生不同的效果，其中采用SNV and Detrend 得到的RSQ 最大.

2.2.3 回归方法的选择（表4）

表4 不同回归方法处理得到的过氧化氢酶定标参数

由表4 可知，偏最小二乘法得到的定标模型RSQ 最大为0.947.因此，采用SNV and Detrend 和“2，1，1，1”方法处理光谱图，运用偏最小二乘法回归技术建立小麦过氧化氢酶活性定标模型最优.

2.3 定标模型的验证

2.3.1 模型内部验证

利用Winisi Ⅱ软件对所参与定标的样品进行内部验证，结果如图2 所示，模型的预测值和化学测定值相关系数为0.915，化学测定值平均值为57.6 mg/g，预测值平均值为56.9 mg/g，二者基本一致.定标集的近红外预测值与化学测定值之间具有良好的相关性.

图2 定标集过氧化氢酶预测值和化学测定值的相关性

2.3.2 模型外部验证

定标模型建好后，除了用它自身的RSQ 和SEC 大小衡量外，还要用外部检验的方法来评价所建模型的可靠性，来证明模型在实际使用中的效果.研究中选用未参与定标的一组样品31 份对定标方程进行检验.结果表明，样品中过氧化氢酶实测值与预测值之间的相关系数R 为0.970，实测值的平均值为59.0 mg/g，预测值的平均值为58.9 mg/g，二者十分接近，说明近红外预测值与实测值之间具有良好的相关性.对模型预测值和实测值进行t 配对检验，得到t 值为1.243（P ＜0.05），5%显著性水平内差异不显著.检验标准偏差为3.363，SEC 值为3.361，两者之间差异不大，说明该预测方程可靠性较高.31 份样品的实测值与预测值的平均绝对偏差为0.370，定标模型的预测准确性较好.

3 结论

运用近红外光谱分析技术建立了小麦过氧化氢酶含量的近红外分析模型，并验证了检测模型的精确度.定标方程的1-VR 值为0.688，RSQ 值为0.947，SEC 值为3.363，SECV 值为7.303，SEP 值为3.361.结果表明，样品的预测值与测定值之间的相关性比较高，近红外光谱检测技术可以作为测定小麦过氧化氢酶含量的一种方法，可代替常规标准方法，应用于小麦品质的快速评价.

［1］邱丽娟，常汝镇.大豆种质资源描述规范和数据标准［M］.北京:中国农业出版社，2006.

［2］李卫东，张孟臣.黄淮海夏大豆及品种参数［M］.北京:中国农业科学技术出版社，2006.

［3］Xu Y B，Crouch J H.Marker assisted selection in plant breeding from publications to practice［J］.Crop Science，2008，48:391-407.

［4］王华芳，展海军.过氧化氢酶活性测定方法的研究进展［J］.科技创新导报，2009，19:1-3.

［5］朱星晔，韩育梅.氧化氢酶的检测方法及其在大米贮藏中的应用［J］.农产品加工，2010，8:103-105.

［6］李君霞，张洪亮，严衍禄，等.水稻蛋白质近红外定量模型的创建及在育种中的应用［J］.中国农业科学，2006，39:836-841.