诱导激活剂对不同曲霉菌株淀粉酶组分的激活作用

张贺迎，徐新霞，任 磊，武金霞*

（1.河北大学 生物技术研究中心，河北 保定 071002；2.河北大学 生命科学院，河北 保定 071002）

酱油是中国传统的酿造调味品，是酿造微生物多种酶系协同作用于物料的结果。酿造微生物在生长繁殖过程中会分泌蛋白酶、淀粉酶、果胶酶等多种酶系，这些酶的活力、含量及比例影响酱油的产量和质量[1-2]。氨基酸态氮目前仍是衡量酱油酿造质量和产量的重要指标，在研究和生产中，常以米曲霉蛋白酶活力高低衡量菌株性能和跟踪酱油酿造过程[3-4]。但酱油是集色、香、味、体于一体的调味品，酱色是衡量酱油感官质量的重要组成部分，其形成主要依赖于非酶促褐变反应，即酱醪中的蛋白质原料、淀粉质原料及其分解产物氨基酸、单糖类等物质在一定条件下发生美拉德化学反应[5-7]。

淀粉酶是指能催化淀粉转化成葡萄糖、麦芽糖及其他低聚糖的所有酶的总称，在酱油色、香、味、体的形成中起重要作用[8]。成曲中淀粉酶的组成及活力对酱油的品质有重要的影响[9]。

米曲霉（Aspergillusoryzae）和黑曲霉（Aspergillusniger）是酿造酱油制曲的重要微生物，不同菌株具有自身的特性。本实验室发明的激活酿造技术能提高酱油产量和质量，缩短发酵周期[10-13]。研究诱导激活剂对菌株淀粉酶组分及活性的影响，为了解诱导激活剂对不同菌株的激活特异性及淀粉酶在酱油酿造中的作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

米曲霉（Aspergillus oryzae）沪酿3.042、米曲霉3.362、米曲霉HL、米曲霉ZH、米曲霉3042KG；黑曲霉（Aspergillus niger）沪酿3350、黑曲霉3.324。

豆粕麸皮固体培养基；Tris，可溶性淀粉，SDS，TritonX-100，丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺等。

1.2 主要仪器和设备

BG-Power 600电泳仪（BAYGENE），电泳槽（北京六一仪器厂，24D），凝胶成像仪Bio-Best 300M（SIM INTERNATION），水浴锅，SH-5磁力搅拌器（BeiDe）。

1.3 方法

1.3.1 酱油成曲浸提液的制备

[14]，制备成曲浸提液。

1.3.2 淀粉酶活力测定

参考文献[15]，采用DNS显色法测定淀粉酶活力，酶活力单位定义为：在pH5.6柠檬酸缓冲液，温度为4.0℃的条件下，5min内水解20mg淀粉产生1mg麦芽糖的酶量为一个酶活力单位，以U表示。

1.3.3 Starch-PAGE检测浸提液淀粉酶组分数量及活性比例分析

参考文献[14]作相应的改进，使用凝胶成像分析软件Quantity One_v4.4.0.36分析胶中各条带组分的活性比例。

2 结果

2.1 诱导激活剂对各菌株淀粉酶组分的影响

图1 各菌株淀粉酶活性电泳图谱Fig.1 Electropherogram of amylase activity of each strain

由图1可知，（1）7个曲霉菌株成曲浸提液的淀粉酶组分数量不同，黑曲霉沪酿3350、黑曲霉3.324、米曲霉3.362和米曲霉HL均含有4个淀粉酶组分，而米曲霉3.042和米曲霉3042KG含有3个淀粉酶组分，米曲霉ZH含有2个淀粉酶组分。（2）对于每一个菌株而言，诱导激活剂没有改变淀粉酶组分的数量，只提高了不同淀粉酶组分的活力，进而提高了总淀粉酶活力。（3）将含有4个组分的黑曲霉沪酿3350、黑曲霉3.324、米曲霉3.362和米曲霉HL的组分按迁移率由小到大编号为1、2、3和4，比较7个菌株淀粉酶组分的迁移率。可见，米曲霉沪酿3.042和米曲霉3.042KG显示3个淀粉酶组分，分别与组分2、3、4对应，而米曲霉ZH显示2个淀粉酶组分，分别与组分2、3对应。此外，从淀粉酶条带的透明度分析，组分2是7个菌株中活力最高的组分，在酱油酿造淀粉类物质的降解中可能起主要作用。（4）诱导激活剂对7个菌株不同淀粉酶组分的诱导激活作用不同。对米曲霉沪酿3042的组分4、黑曲霉沪酿3.350的组分4、黑曲霉3.324的组分1、米曲霉HL的组分1和3、米曲霉ZH的组分3、米曲霉3.042KG的组分2和3均有较强的激活作用。

2.2 诱导激活剂对各菌株淀粉酶总活力的影响

由图2可知，添加诱导激活剂以后，各菌株的总淀粉酶活力均有提高，但是由于不同菌株的不同淀粉酶组分对激活剂的敏感性不同（见图1），导致不同菌株总淀粉酶活力的提高程度不同，7个菌株的淀粉酶活力提高分别为15.55%、9.64%、5.42%、14.55%、14.77%、11.14%、15.24%。

3 讨论

米曲霉3.362、HL、ZH、3.042KG是在米曲霉沪酿3.042传代过程中分离出的变异菌株，已经应用于酱油工业生产，经过变异后的各菌株在淀粉酶组分构成和活力分布上也发生了变化。黑曲霉3.350和3.324广泛用于制醋工业，2菌株的淀粉酶活力高于米曲霉菌株（图2），但对激活剂的敏感性较米曲霉菌株差。本研究通过活性PAGE直观观察到各菌株淀粉酶组分及活性差异，对进一步研究诱导激活剂对不同菌株在酱油生产的作用打下了基础。

图2 激活对各菌株淀粉酶活力的影响Fig.2 Effect of activation on amylase activity of each strain

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