荧光法鉴别苹果汁掺伪的研究

左锦静

（河南工业贸易职业学院，河南 郑州 450012）

浓缩苹果汁是我国最主要的苹果加工产品，在世界苹果加工总量中占到90%以上[1]，是世界第二大果汁消费品，仅次于橙汁。目前苹果汁已成为深受我国广大消费者喜爱的一种健康饮品，其营养价值和食疗功效都很高。据报道，鲜苹果汁在抗癌方面有积极作用，其中L-苹果酸能够抑制癌细胞扩散，防止过度肥胖，增加人体血色素、增加皮肤红润度，而且可刺激胃液分泌、促进消化[2]。然而在经济利益的驱使下，一些不法厂商往往会生产一些名不副实甚至以假充真的苹果汁。这不仅会影响果汁行业的健康发展和市场秩序的良好运行，造成严重的经济损失，而且有损消费者健康，更会对构建和谐社会带来诸多不良后果[3]。按照果汁的定义，可以把任何添加了外来物质的果汁说成掺假果汁，因为在果汁类产品中添加任何外来物质都是不被允许的，除了在生产还原果汁时，才可在浓缩果汁原料中添加果汁浓缩时失去的量相同的水[4]。近年来，针对果汁掺假问题，国内外许多学者进行了不同程度的研究，取得了较好成果[3]。

利用荧光分光光度计研究苹果汁的荧光特性，并对苹果汁常见掺伪物质的荧光特性进行测定分析，以期为荧光法快速鉴别苹果汁掺假提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果汁：从自由市场随机取样。

试剂：青苹果香精、青苹果（芬达型）香精、红富士香精：杭州安赛生物科技有限公司；柠檬黄（95%）、亮蓝（85%）：Aladdin Chemistry Co.Ltd；抗坏血酸（分析纯）：洛阳市化学试剂厂；柠檬酸（分析纯）：宿州化学试剂厂；山梨酸（生化试剂）：北京奥博星生物技术责任有限公司；甜蜜素，50倍；苯甲酸钠（分析纯）：洛阳市化学试剂厂；山梨酸钾（天津市光复精细化工研究所）；蔗糖（分析纯）；D-果糖（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。实验用水为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

Cary Eclipse荧光分光光度计（美国，瓦里安公司），仪器序列号EL06053220。

荧光分光光度计参数设置如下：扫描速度，中速（600nm/min）；平均时间0.1s；灵敏度，高；激发夹缝，5nm；发射夹缝，5nm。

针头过滤膜：尼龙6，孔径0.45μm。

1.3 试验方法

1.3.1 原材料处理

将在自由市场上随机买到的苹果汁饮料用离心机过滤，8000r/min离心10min。离心后的上清液用滤纸过滤，收集滤液，备用。苹果汁在移入比色皿之前需先通过0.45微米的针头过滤膜。

1.3.2 掺假物质溶液的配制

掺假物质溶液的配制：将饮料中常见掺假物质分别按其在饮料中的最大允许使用量配制成溶液。其中：VC 0.5g/kg；甜蜜素0.65g/kg；柠檬酸0.1%；山梨酸0.1%；柠檬黄0.1g/kg；苹果香精0.1%；苯甲酸钠1.0g/kg；山梨酸钾0.5g/kg；亮蓝0.025g/kg。

2 结果与讨论

2.1 最佳工作波长的确定

以一系列不同品牌的100%苹果汁为目标溶液，进行荧光激发光谱和发射光谱扫描，确定最佳工作波长。这里以塞浦丽娜牌100%苹果汁为例对得到的图谱加以说明。

对塞浦丽娜牌100%苹果汁进行零级激发扫描，得到零级激发光谱图（见图1）。由图1可以看出，在波长380nm、616nm、791nm处塞浦丽娜牌100%苹果汁都有较强荧光强度的体现，分别以上述3种波长为激发波长进行荧光发射扫描，结果表明，只有当激发波长为380nm时有发射峰，峰值为461nm；再以461nm为发射波长进行荧光激发扫描得到基本呈镜像对称的激发光谱和发射光谱（见图2），这说明塞浦丽娜牌100%苹果汁在激发波长为380nm处确有荧光。

图1 塞浦丽娜牌100%苹果汁零级激发光谱图Fig.1 Zero level excitation spectrum of Cyprina 100% apple juice

以380nm波长附近范围为激发波长对塞浦丽娜牌100%苹果汁进行3D发射扫描，得其一系列发射光谱（见图3），并生成相应的等值图（见图4）。根据图3和图4选取450nm附近范围为发射波长进行荧光激发扫描，得一系列荧光激发光谱（见图5），并生成等值图（见图6）。

图2 塞浦丽娜牌100%苹果汁380nm激发下的发射光谱及461nm发射下的激发光谱Fig.2 Emission spectra at 380nm and excitation spectrum at 461nm of Cyprina 100% apple juice

图3 塞浦丽娜牌100%苹果汁360nm～400nm的3D发射光谱图Fig.3 3D Emission spectra of Cyprina 100% apple juice at 360nm～400nm

图4 塞浦丽娜牌100%苹果汁360nm～400nm的3D发射光谱等值图Fig.4 3D Emission spectra contour figure of Cyprina 100% apple juice at 360nm～400nm

图5 塞浦丽娜牌100%苹果汁440nm～490nm的3D激发光谱Fig.5 3D excitation spectrum of Cyprina 100% apple juice at 440-490nm

图6 塞浦丽娜牌100%苹果汁440nm～490nm的3D激发光谱等值图Fig.6 3D excitation spectrum contour figure of Cyprina 100% apple juice at 440nm～490nm

同时，可以得到其他3种100%苹果汁的激发光谱及其对应的3D激发光谱等值图（见图7～12）。

图7 大湖牌100%苹果汁450nm～470nm的3D激发光谱Fig.7 3D excitation spectrum of Great Lake 100% apple juice at 450nm～470nm

图8 大湖牌100%苹果汁450nm～470nm的3D激发光谱等值图Fig.8 3D excitation spectrum contour figure of Great Lake 100%apple juice at 450 nm～470nm

图9 汇源牌100%苹果汁450nm～495nm的3D激发光谱Fig.9 3D excitation spectrum of Huiyuan 100% apple juice at 450nm～495nm

图10 汇源牌100%苹果汁450nm～495nm的3D激发光谱等值图Fig.10 3D excitation spectrum contour figure of Huiyuan 100%apple juice at 450 nm～495nm

图11 发那牌100%苹果汁450nm～490nm的3D激发光谱Fig.11 3D excitation spectrum of Pfanner 100% apple juice at 450nm～490nm

图12 发那牌100%苹果汁450nm～490nm的3D激发光谱等值图Fig.12 3D excitation spectrum contour figure of Pfanner 100%apple juice at 450 nm～490nm

由图6～12并结合荧光强度初步选定379nm为最佳激发波长。以379nm为激发波长，分别对上述4种品牌100%苹果汁进行发射扫描，得到发射光谱（见图13）。根据试验结果确定最佳工作波长：最佳激发波长379nm，最佳发射波长463nm。

2.2 掺假物质的荧光扫描

在379nm激发波长和已定仪器条件下，分别对各种掺假物质溶液进行荧光扫描，得到各种掺假物质溶液的发射光谱（见图14和图15）。结果表明，几种常见的掺假物质在379nm激发波长下，在波长454nm～465nm处均没有荧光或荧光强度很弱，可见这些掺假物质并不影响苹果汁原有的荧光特性。

图13 汇源、大湖、发那、塞浦丽娜四种品牌100%苹果汁379nm发射光谱Fig.13 Emission spectra of Huiyuan,Great Lakes,Pfanner and Cyprina 100% apple juice at 379nm

图14 各种掺伪物质在379nm处的发射光谱（蔗糖、VC、甜蜜素、柠檬酸、果糖、柠檬黄、0.1%青苹果香精、0.1%红富士香精、日落黄）Fig.14 Emission spectra of all kinds of adulterated substance at 379nm (sucrose,VC,sodium cyclamate,citric acid,fructose,citric yellow,0.1% green apple flavor,0.1%Red Fuji flavor,sunset yellow)

图15 山梨酸钾、苯甲酸钠、安赛蜜和亮蓝在379nm处的发射光谱Fig.15 Emission spectra of potassium sorbate,sodium benzoate,acesulfame-K and brilliant blue at 379nm

因此，本试验所得到的苹果汁荧光特性可用于检测完全配置型苹果汁掺假，即真苹果汁在379nm激发波长下，在454nm～465nm处有最大发射峰；而假苹果汁则无此荧光特性。

2.3 标准曲线的制作及样品溶液的测定

2.3.1 标准曲线的制作

由图13可知，在379nm激发下，对于相同浓度的苹果汁，大湖牌苹果汁荧光强度最大、汇源牌苹果汁荧光强度最小。因此选取大湖牌100%苹果汁配制一定浓度梯度的标准系列溶液，并在已确定工作波长处和已确定的仪器条件下，测定其荧光强度（见表1）。

表1 大湖牌苹果汁系列溶液的荧光强度测定值Table 1 Fluorescence intensity of Great Lakes apple juice series solution

由表1可以看出，荧光强度与溶液浓度呈正比，即IF=KF·c（其中IF为荧光强度，KF为常数，c为样品浓度），但这种线性关系只在极稀的溶液中才成立，对于较浓的溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，导致荧光强度与浓度不呈线性关系[5]。所以，本文选取线性关系较好的浓度为10%～30%的点制做标准曲线（如图16），得到标准曲线方程为：IF=1.3905·c+10.575，其中IF为荧光强度/a.u.，c为溶液浓度/%，回归系数为0.9716。

图16 大湖苹果汁浓度10%～30%的标准曲线Fig.16 The standard curve of Great Lakes apple juice concentration 10%～30%

2.3.2 验证实验

在相同测定条件下，测定含原果汁的样品溶液的荧光强度。利用标准曲线或标准曲线方程计算出被测样品溶液中原果汁的含量。在市场随机选取3种苹果汁进行测定，其样品编号、标签上标示的果汁含量、测定结果及计算结果见表2。

表2 市售果汁样品中原果汁含量的测定Table 2 Determination of raw juice content for commercial fruit juice samples

由表2可知，根据标准曲线方程计算出的苹果汁饮料中的原果汁含量与标签上标示的果汁含量基本相符。

2.4 温度对苹果汁荧光特性的影响

配制20%和80%的汇源苹果汁标准溶液，在已确定工作波长处和已确定的仪器条件下分别测定其在常温和冷藏条件下（冷藏时间为7h）的荧光强度（见表3）。结果表明荧光强度随温度升高而降低，这符合一般荧光测定规律。这也说明在确定最佳工作条件及测定苹果汁饮料中原果汁近似含量时应尽量保持温度一致。

表3 温度对苹果汁荧光强度的影响Table 3 Effect of temperature on fluorescence intensity of apple juice

3 结论

（1）确定最佳工作波长：激发波长379nm，发射波长463nm。

（2）VC、蔗糖、果糖、甜蜜素、安赛蜜、柠檬酸、柠檬黄、日落黄、亮蓝、0.1%青苹果香精、0.1%红富士香精、山梨酸钾、苯甲酸钠等苹果汁中常见的掺假物质以及配制的模拟苹果汁在最佳工作波长处基本无荧光强度或荧光强度很弱，这表明上述物质对苹果汁的荧光特性无干扰。

（3）本试验所得到的苹果汁荧光特性可用于检测完全配制型苹果汁掺假，即真苹果汁在379nm激发波长下，在463nm处有最大发射峰；而假苹果汁则无此荧光特性。另外，可通过标准曲线及标准曲线方程计算低浓度苹果汁饮料中原果汁含量。

（4）苹果汁的荧光强度随温度升高而降低，所以测定时应尽可能保证温度条件一致。

4 展望

近年来，荧光分析法已经被广泛应用于果汁的检测。如胡耀星等[6]用荧光法鉴定柑桔汁饮料掺假，该方法快速、简单、准确、灵敏度高。表面荧光法激发-发射矩阵被应用于评估热处理苹果汁中的非酶褐变，该方法为监控果汁的非酶褐变提供了一个可行的方法[5]。荧光分析法已在果汁检测中初有成就，而且该方法优势明显，但该法也有不足之处，如在测定时受溶剂、温度、溶液的pH值等的影响。相信在科研工作者的共同努力下，该领域的应用研究一定能够取得突破性进展，荧光分析法也将越来越多地被应用于果汁质量检测中[7]。

[1]黎未然，高志明.中红外光谱法评价苹果浓缩汁质量评价研究[J].广东农业科学，2011（12）：98-100.

[2]魏德保.果品营养与食疗[M].北京：中国林业出版社，1987.

[3]韩建勋，陈 颖，黄文胜，等.苹果汁鉴伪技术研究进展[J].食品科技，2008（8）：205-208.

[4]朱孔岳，周 静，高一璇，等.苹果汁中果汁含量测定方法研究[J].检测与分析，2010，13（5）：29-33.

[5]ZHU DZ,JI BAOPING.Evaluation of the non-enzymatic browning in thermally processed apple juice by front-face fluorescence spectroscopy[J].Food Chem，2009，113：272-279.

[6]胡耀星，袁三喜.荧光法鉴定柑桔汁饮料掺假[J].分析检测，2005，26（5）：166-168.

[7]杨玉玲，刘海乐.荧光分析在农药研究中的应用[J].生命科学仪器，2007，5（9）：9-12.