促红细胞生成素衍生肽对顺铂所致大鼠急性肾损伤的剂量反应关系的探讨

柴 璐，王 锋，范亚平， 杨斌，徐玉音，周建萍

急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的两大基本病理原因是缺血与肾毒性损伤。随着多种新型药物如抗肿瘤药物、抗生素、非甾体抗炎药等药物的应用，药物引起的AKI越来越得到重视。国内外已经对肾毒性损伤所致AKI进行了广泛研究。已有前期的研究结果显示人工合成的新型促红细胞生成素衍生肽(HBSP)对缺血再灌注所致AKI大鼠具有较好的肾脏保护作用[1]，但其使用剂量与肾脏保护作用效果的关系，目前罕有报道。本研究探讨HBSP对顺铂所致AKI是否有肾脏保护作用及其剂量反应关系，为临床治疗提供新思路和方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性6月龄SD大鼠,SPF级,体质量200～220 g,85只,由南通大学实验动物中心提供，动物使用符合江苏省动物管理委员会管理条例规定，实验者获得江苏省实验动物从业人员岗位证书。大鼠自由摄食和饮水,室温20～26 ℃,湿度40%～70%,光照条件:12 h明/12 h暗。

1.2 主要试剂 HBSP(上海科肽生物科技有限公司,纯度:98.12%)，顺铂(江苏豪森药业股份有限公司,产品批号：120804，规格：6 ml/30 mg,生成日期：2012-08-28)，TUNEL试剂盒(瑞士Roche，产品批号：11684817910，生成日期：2012-09-04)。

1.3 动物模型与分组 按随机数字表将SD大鼠分为5组，分别为：对照组(5只)、顺铂组(20只)、HBSP(8 nmol/kg)组(20只)、HBSP(16 nmol/kg)组(20只)、HBSP(32 nmol/kg)组(20只)。除对照组外其他各组又分为第1、3、5、7天各亚组，每亚组5只。对照组5只大鼠腹腔单次注射0.9%氯化钠溶液7 ml/kg。将顺铂用0.9%氯化钠溶液配成1 mg/ml溶液，顺铂组20只大鼠腹腔单次注射顺铂7 ml/kg。HBSP(8 nmol/kg)组20只大鼠、HBSP(16 nmol/kg)组20只大鼠、HBSP(32 nmol/kg)组20只大鼠首次静脉注射各对应剂量的HBSP，5 h后腹腔单次注射顺铂7 ml/kg，后每隔24 h均静脉注射各亚组对应剂量的HBSP。所有大鼠予以标准饲料喂养，自由饮水。

1.4 检测方法 全自动生化分析仪测定大鼠血尿素氮及血肌酐。大鼠肾组织采用4%多聚甲醛固定，后行苏木素-伊红(HE)染色，观察肾小管病理改变。采用TUNEL法观察肾小管上皮细胞凋亡情况，严格按照试剂盒说明书步骤操作，以阳性细胞占细胞总数百分比双盲法评分表示凋亡程度。

2 结果

2.1 各组大鼠肾功能指标的改变 各组大鼠不同时间血尿素氮及肌酐水平比较，差异均有统计学意义(尿素氮：F组间=441.456，F时间=10.643，P<0.001；肌酐：F组间=417.933，F时间=9.412，P<0.000 1)；其中第1、3、5、7天顺铂组、HBSP(8 nmol/kg)组、HBSP(16 nmol/kg)组、HBSP(32 nmol/kg)组血尿素氮及肌酐水平较对照组均增高，差异有统计学意义(P<0.05)；HBSP(8 nmol/kg)组、HBSP(16 nmol/kg)组、HBSP(32 nmol/kg)组血尿素氮及肌酐水平较顺铂组均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；HBSP(16 nmol/kg)组第7天血尿素氮及肌酐水平较HBSP(8 nmol/kg)组均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；HBSP(32 nmol/kg)第5天、第7天血尿素氮及肌酐水平较HBSP(8 nmol/kg)组和HBSP(16 nmol/kg)组均降低，差异有统计学意义(P<0.05，见表1、2)。

2.2 各组大鼠血红蛋白的改变 各组大鼠不同时间血红蛋白水平比较，差异无统计学意义(F组间=566 645.213，F时间=1.581，P=0.200,见表3)。

2.3 各组大鼠肾组织病理学比较 HE染色可见对照组大鼠肾组织病理学正常(见图1)。顺铂组大鼠肾皮质损伤，肾小球轻度肿大，近端肾小管上皮细胞出现肿胀并有空泡形成，并有小管上皮细胞脱落，透明管型形成，至第3天损伤达到顶峰，后肾组织损伤逐渐减轻，至第7天有肾小管再生现象(小管上皮细胞扁平，管腔扩张，细胞核排列紊乱)(见图2)。HBSP(8 nmol/kg)、HBSP(16 nmol/kg)、HBSP(32 nmol/kg)组大鼠肾组织损伤明显减轻，第3天时管腔稍有肿胀，小管上皮细胞脱落不明显，可见少量透明管型和红细胞管型。在第5天时肾组织损伤程度进一步减轻，已出现肾小管再生现象(小管上皮细胞扁平，管腔扩张，细胞核排列紊乱)，且随着HBSP剂量的加大，小管再生现象愈加明显，至第7天时，上述3组的肾组织已基本同于对照组肾脏病理(见图3～5)。

表1 各组大鼠不同时间血尿素氮水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与顺铂组比较，△P<0.05；与HBSP(8 nmol/kg)组比较，▲P<0.05；与HBSP(16 nmol/kg)组比较，●P<0.05

表2 各组大鼠不同时间血肌酐水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与顺铂组比较，△P<0.05；与HBSP(8 nmol/kg)组比较，▲P<0.05；与HBSP(16 nmol/kg)组比较，●P<0.05

图2 顺铂组肾组织病理学(HE染色，×400)图3 HBSP(8 nmol/kg)组肾组织病理学(HE染色，×400)

Figure2 Renal tissue pathological section in cisplatin groupFigure3 Renal tissue pathological section in HBSP(8 nmol/kg)group

图4 HBSP(16 nmol/kg)组肾组织病理学(HE染色，×400)图5 HBSP(32 nmol/kg)组肾组织病理学(HE染色，×400)

Figure4 Renal tissue pathological section in HBSP(16 nmol/kg)groupFigure5 Renal tissue pathological section in HBSP(32 nmol/kg)group

Table3 Comparison of serum hemoglobin levels at different time points among various rat groups

组别只数实验前第1天第3天第5天第7天对照组5139±14139±14139±14139±14139±14顺铂组5141±14135±11139±13140±15137±12HBSP(8nmol/kg)组5135±13133±13139±15139±13142±13HBSP(16nmol/kg)组5143±14136±14133±13133±14139±13HBSP(32nmol/kg)组5140±13134±14130±13131±13136±14

2.4 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况 各组大鼠不同时间肾组织TUNEL染色百分比比较，差异有统计学意义(F组间=226.100，F时间=9.553，P<0.001)；其中第1、3、5、7天顺铂组、HBSP(8 nmol/kg)组、HBSP(16 nmol/kg)组、HBSP(32 nmol/kg)组大鼠肾组织TUNEL染色百分比较对照组均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；HBSP(8 nmol/kg)组、HBSP(16 nmol/kg)组、HBSP(32 nmol/kg)组较顺铂组均降低(P<0.05)；HBSP(16 nmol/kg)组第7天较HBSP(8 nmol/kg)组降低(P<0.05)；HBSP(32 nmol/kg)组第5天较HBSP(8 nmol/kg)组、第7天较HBSP(8 nmol/kg)组和HBSP(16 nmol/kg)组均降低(P<0.05，见表4)。对照组可见肾小管上皮细胞细胞核排列整齐，无深褐色TUNEL染色阳性细胞(见图6)。顺铂组在第3天时可见肾小管管腔重度改变，肾小管上皮细胞重度裸露，TUNEL染色阳性细胞较多，至第5天、第7天肾小管管腔扩张减少，TUNEL染色阳性细胞显著减少(见图7)。HBSP(8 nmol/kg)、HBSP(16 nmol/kg)、HBSP(32 nmol/kg)组第3天均可见较多TUNEL染色阳性细胞，在第5天、第7天时均有明显减少，且随着HBSP剂量的加大，TUNEL阳性细胞减少趋势愈加明显(见图8～10)。

图1 对照组肾组织病理学(HE染色，×400)

表4 各组大鼠不同时间肾组织TUNEL染色百分比比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与顺铂组比较，△P<0.05；与HBSP(8 nmol/kg)组比较，▲P<0.05；与HBSP(16 nmol/kg)组比较，●P<0.05

图7 顺铂组肾组织病理学(TUNEL染色，×400)图8 HBSP(8 nmol/kg)组肾组织病理学(TUNEL染色，×400)

Figure7 Renal tissue pathological section in cisplatin groupFigure8 Renal tissue pathological section in HBSP(8 nmol/kg)group

图9 HBSP(16 nmol/kg)组肾组织病理学(TUNEL染色，×400)图10 HBSP(32 nmol/kg)组肾组织病理学(TUNEL染色，×400)

Figure9 Renal tissue pathological section in HBSP(16 nmol/kg)groupFigure10 Renal tissue pathological section in HBSP(32 nmol/kg)group

图6 对照组肾组织病理学(TUNEL染色，×400)

3 讨论

流行病学调查显示AKI的发生率不断升高，且病死率依然居高不下，尽管对AKI的了解和认识不断增多和深入，支持或辅助的治疗措施也有进展，但AKI的预后仍恶劣，特别是缺乏早期特异有效的干预和治疗措施。

随着大量新型药物如抗肿瘤药物、抗生素、生物制剂在临床上的广泛应用，药物引起的AKI呈逐渐上升趋势，肾中毒已经成为AKI的重要因素，国内外已经对肾毒性损伤所致AKI进行了广泛研究。顺铂是一种细胞增殖抑制剂,广泛用于睾丸癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、骨癌和头颈癌等实体肿瘤的治疗。顺铂的抗肿瘤效率高，但同时具有明显的剂量依赖性肾毒性[2]，以肾小球与肾小管均受损为特征，主要表现为氮质血症、多尿和肾衰竭等。本实验采用顺铂诱导的AKI大鼠模型,该动物模型有成模时间短、成功率高、实验操作简单等优点，现已广泛应用于各种有关AKI的研究中[3]。

近年来研究发现促红细胞生成素(EPO)对顺铂所致AKI的肾脏有保护作用，其机制可能与其抗氧化应激及抗炎、抑制细胞凋亡的作用有关[4-5]。但根据多种动物和临床实验，启动EPO组织保护作用需要较高的剂量，而由此产生的促红细胞生成及血栓形成的不良反应已限制了其在临床上的广泛应用。研究发现肾脏及其他多种器官存在一种保护性的β共同体(β common recptor，βcR)，其能与EPO受体(EPOR)形成异源二聚体，不启动造血信号的转导，但可减轻炎症反应，抑制细胞凋亡，发挥组织保护作用[6]。Brines等[7]对EPO的蛋白分子结构及其受体进行了研究，表明EPO由4个螺旋结构(Helix A～D)连接成环，当EPO与其同源二聚受体结合时，Helix B的亲水表面并不与其接触，且其不含赖氨酸，不能被氨甲酰化，不能与EPOR结合而发挥促红细胞生成的作用，即证实βcR的配体为Helix B，研究者随即在Helix B螺旋亲水表面上挑选出11个氨基酸残基，人工合成线性多肽链HBSP，达到了其发挥组织保护作用和促红细胞生成作用分离的目的。国内外研究发现HBSP可减轻炎症反应及抑制肾小管上皮细胞凋亡，对肾脏缺血再灌注的肾功能损伤有明显的保护作用[8-9]。

已有研究证实了HBSP对缺血再灌注所致AKI的保护作用，对AKI大鼠采用8 nmol/kg剂量重复静脉注射HBSP[1]，但相同剂量乃至更高剂量的HBSP对顺铂所致的AKI大鼠静脉注射能否带来更好的肾脏保护作用，目前罕有报道。本实验采用大剂量(16 nmol/kg、32 nmol/kg)、多次注射(每隔24 h重复静脉注射)的方法尽可能使HBSP稳定地发挥出肾功能保护作用。各组大鼠肾组织HE染色显示：与顺铂组大鼠肾组织相比，HBSP(8 nmol/kg)组、HBSP(16 nmol/kg)组、HBSP(32 nmol/kg)组大鼠肾小管损伤明显减轻，提示HBSP对顺铂所致AKI有保护作用。且本实验证实各种剂量的HBSP对血红蛋白无明显生成作用，这一点正是HBSP优于EPO的方面。大鼠肾组织TUNEL染色百分比结果显示与HBSP(8 nmol/kg)组相比，HBSP(16 nmol/kg)组于第1天、第3天、第5天有所降低，但无差异，于第7天降低；HBSP(32 nmol/kg)组大鼠肾组织TUNEL染色百分比于第1天、第3天有所降低，但无差异，第5天、第7天降低。该结果显示HBSP的剂量使用越大，其发挥肾功能保护作用越明显，可缩短其肾功能恢复的时间，提示HBSP使用剂量与顺铂所致AKI的肾脏保护作用可能存在正相关关系，其机制考虑可能与HBSP的剂量加大，其在循环系统中的有效浓度时间延长有关。

综上所述，HBSP是一种新型的肾功能保护药物，其作用机制以及使用方法还有待于进一步的研究来确定，其突出的组织保护作用和较小的不良反应为药物导致AKI的治疗开辟了新的治疗思路和途径，为药物治疗AKI带来广阔的应用前景。

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