金匮肾气丸对恐伤肾模型仔鼠多巴胺水平的调节作用研究

王红艳，张先庚，刘 琴，梁小利，彭德忠

《素问·举痛论》云：“余知百病生于气也，恐则气下，恐则精却，却则上焦闭，闭则气还，还则下焦胀，故气下行矣”[1]。恐为肾志，恐则气下，恐则精却，过度恐惧可致肾精亏虚。本实验根据恐伤肾的中医病因病机理论，用模拟地震恐吓孕鼠[2]，伤其肾精，造成孕鼠肾精亏虚，并给予金匮肾气丸进行干预，以此研究金匮肾气丸对孕鼠产仔数量及仔鼠出生体质量、多巴胺水平的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠72只，其中雌性48只，雄性24只；体质量224.5～260.5 g，均无生育史。由成都达硕生物科技有限公司〔生产合格证号：SCXK(川)2008-24〕 提供。实验前置SD大鼠于室温内适应环境1周，室温20～22 ℃，湿度50%～60%。饲料由成都达硕生物科技有限公司〔生产许可证号SCXK(川)2010-01〕 提供。

1.1.2 药物 金匮肾气丸：由中药地黄、山药、山茱萸(酒炙)、茯苓、牡丹皮、泽泻、桂子、附子(炙)、牛膝(去头)、车前子(盐炙)组成，北京同仁堂科技发展股份有限公司生产，批号8030876。

1.1.3 仪器与试剂 地震测速器(由成都高新减灾研究所研制，成都市美幻科技有限公司生产)、Multiskan MK3型酶标仪(美国Thermo Electron Corporation，编号：BKY-ZX-014)、LD5-10B型低速离心机(北京医用离心机厂，编号：BKY-ZX-0162)、天平秤、多巴胺(201112,dze30326)试剂盒(生产公司：R&D Systems China Co.Ltd)、微量加液器、吸头、EP管，眼科剪等手术器械。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 按雌∶雄2∶1比例随机配对交配，次日清晨发现阴栓者为妊娠，当天作为受孕的第1天，发现妊娠后分笼饲养。将34只初次受孕孕鼠采用随机数字表法分为对照组11只，体质量(234.9±2.2)g；地震组11只，体质量(235.0±2.0)g；中药组12只，体质量(235.2±2.0)g。3组体质量比较，差异无统计学意义(F=0.186，P=0.767)。

1.2.2 实验方法 将3组孕鼠放置于标准鼠笼中饲养，从孕期第1天开始给予相同的饮水(自来水)和光照。地震组和中药组模拟地震震动2次/d，15～20 min/次。利用地震测速器测定数据如下：烈度:9.6～10.5,三轴合成峰值加速度:1 350～1 400 mg,水平合成峰值加速度:1 000～1 050 mg，东西向峰值加速度:850～900 mg,南北向峰值加速度:1 050～1 100 mg,垂直向峰值加速度:800～850 mg。中药组用药量按成人公斤体质量用量的10倍进行折算(根据成人体质量50～60 kg，每日服用约10 g，折算出250～300 g体质量的大鼠服用量为0.5～0.6 g/d)，将中药金匮肾气丸研碎后混入常规饲料中喂养。地震组和对照组喂养普通饲料。模拟地震刺激及中药饲料喂养持续干预至孕期第19天后停止，将每只孕鼠单独放置于标准孕鼠盒饲养，待产仔后各组按统一方法饲养，停止干预措施。

1.2.3 观察指标及测定 观察恐伤孕鼠死亡率、产仔率、产仔数量及仔鼠出生体质量，饲养至25 d，仔鼠部分死亡，对照组存活35只、地震组24只、中药组34只，测量仔鼠的行为能力(亮盒排便实验)。同时在各组随机抽取10只，共30只仔鼠，从股动脉采全血2 ml，全血标本于室温放置10～20 min凝固分层后，离心半径15 cm，2 000～3 000 r/min,离心20 min，收集上清液。采用酶联免疫吸附试验法检测多巴胺水平，按说明书操作，Multiskan MK3型酶标仪检测吸光度，吸光度的检测波长为 450 nm。

2 结果

2.1 3组孕鼠死亡率、产仔率及产仔数量比较 地震组死亡3只，对照组和中药组均无死亡孕鼠。3组产仔率比较差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

表1 3组仔鼠产仔率比较

2.2 3组仔鼠出生体质量比较 对照组共产鼠65只，地震组共产鼠38只，中药组共产鼠68只。3组仔鼠出生体质量比较差异有统计学意义(P<0.05)；其中地震组仔鼠出生体质量较对照组和中药组降低，中药组较对照组降低，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表2 3组仔鼠出生体质量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与地震组比较，△P<0.05

2.3 金匮肾气丸对仔鼠行为能力的影响 3组仔鼠亮盒排便阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)；其中地震组亮盒排便阳性率较对照组和中药组升高，差异均有统计学意义(P<0.05，见表3)。

表3 3组仔鼠亮盒排便阳性率比较〔n(%)〕

注：与地震组比较，*P<0.05

2.4 金匮肾气丸对仔鼠多巴胺水平的影响 3组仔鼠多巴胺水平比较差异有统计学意义(P<0.05)；其中地震组仔鼠多巴胺水平较对照组和中药组降低，差异均有统计学意义(P<0.05，见表4)。

表4 3组仔鼠多巴胺水平比较

注：△采用秩和检验；与地震组比较，*P<0.05

3 讨论

肾主生殖，恐伤肾阳，伤及冲任，动摇了雌鼠受孕的基础，肾虚直接影响孕育。此为，恐伤肾精肾气，恐则气下，母代气机失调，肾气不致，难于安合成孕，难于聚气成胎，难于聚精养胎。生殖功能自然受到严重的影响，甚至丧失生殖能力。本研究中地震组孕鼠产仔数量较中药组减少，说明其生殖功能减退。

中医认为，先天肾精(包括父母天癸)是胚胎发育的遗传物质基础，可以促进个体的生长发育[3]；母代肾气亏虚，子代肌骨筋肉生长所需的营养物质供应不足，导致其出生体质量降低。《素问·奇病论》中说“人生而有癫疾者，病名为胎病，此得之在母腹中时，其母有所大惊，气上而不下，精气并居，故令子发为癫疾也”。系指孕妇妊娠期间由于惊恐所致的气机逆乱，会影响胎儿的健康发育。本研究结果显示，地震组仔鼠出生体质量较对照组低。

亮盒排便是行为遗传学上的一个经典实验，它用二便粒次作为衡量动物情绪遗传力大小的指标，也可以作为中医“恐伤肾”、“恐则气下”的客观指标之一[4]。《医学入门·脏腑》说：“肾有二枚……纳气，收血，化精，为封藏之本”。《素问·金匮真言论》说：“肾……开窍于二阴”，故肾司前后二阴，为封藏之本，“恐伤肾”，封藏失职，二阴失约，而二便排泄次数增多。地震组仔鼠在亮盒排便测试中，阳性率明显高于对照组和中药组。近年来，无论是动物实验还是人类试验均已证明，孕期心理应激不仅对胎儿神经系统、生长发育(体质量、身长等)产生影响[5-6]，而且造成子代的远期功能损害，甚至与某些生理解剖缺陷相关联[7]。

有人把《妇人大全良方》的胎教思想归纳为5方面进行分析，其中第一是孕妇情绪与胎教，可见情绪对孕妇的重要性[8]。多巴胺是大脑分泌的一种神经递质，主要参与情感、运动、认知、摄食、正性强化等多种行为过程，多巴胺通过其相应的膜受体发挥作用。D1受体(D1R)主要与空间学习能力有关，D2受体(D2R)功能受损将引起运动减少,协调、空间识别和短期记忆能力下降[9-10]。本研究发现地震组多巴胺水平低于其他两组，提示地震恐惧可降低多巴胺水平，而多巴胺水平的降低可引发抑郁、恐惧等情志障碍，如张春虎等[11]发现慢性应激大鼠的多巴胺水平明显低于空白对照组。补肾中药治疗后多巴胺水平可恢复正常,提示金匮肾气丸可能有恢复多巴胺的合成以及代谢功能。

金匮肾气丸来源于汉代张仲景所著的《金匮要略》一书，其作用为温补肾阳，调节肾的生理功能。基于“恐伤肾”和“补肾”的理论基础，本研究采用补肾中药金匮肾气丸来调护地震恐惧对孕鼠的损害，结果提高了孕鼠的产仔数、增加了仔鼠出生体质量，提高了仔鼠的行为能力，说明该方可有效纠正地震恐惧对母鼠造成的“肾不藏精”、“肾气虚衰”等不良影响，使仔鼠生长发育迟缓、体质量降低等不良症状得到改善。同时有效地提高恐惧应激下仔鼠血浆多巴胺水平，表明该方对孕鼠恐伤肾病理变化有防治作用。说明补肾法及其方药具有良好的抗恐惧应激损伤作用。本研究亦为进一步研究中医学肾脏与恐惧心理应激的关系提供了一定的实验依据，对中医恐伤肾理论的研究具有良好的理论价值。

1 孙广仁.中医基础理论[M].北京:中国中医药出版社,2007:96-98.

2 刘琴,张先庚,梁清芳,等.从SD大鼠子代的体重与身长论证优裕“胎教”和地震“胎损”环境的造模[J].辽宁中医药大学学报,2012,14(1):88-90.

3 张登本.中医学基础[M].北京:中国中医药出版社,2007:47.

4 王米渠,吴斌,冯韧.“恐伤肾”母子两代的胜利研究[J].福建中医药,2003,34(1):3-4.

5 Lee W,Balasubramaniam M，Deter RL,et al.Fetal growth parameters and birth weight:their relationship to neonatal body composition[J].Ultrasound Obstet Gynecol，2009，33(4):441-446.

6 Vaag A.Low birth weight and early weight gain in the metabolic syndrome:consequences for infant nutrition[J].Int J Gynaecol Obstet,2009,104 (Suppl 1):S32-S34.

7 范粉灵,岳亚飞.孕期心理应激对其子代的影响[J].国外医学妇幼保健分册，2005,16(1):21-23.

8 张越平,阮氏水.从《妇人大全良方-胎教门》看中医胎教学[J].天津中医药,2012,29(6):606-607.

9 刘莉莉.SKF-81297对ADHD动物模型SHR大鼠行为及其影响机制的研究[D].济南：山东大学,2008.

10 胡家庆,殷明,章建程,等.心理应激对大鼠多巴胺受体功能的影响及酪氨酸的干预作用[J].解放军医学杂志，2006,31(1):187-189.

11 张春虎,胡随瑜,陈昌华.白松片对应激大鼠行为及额叶皮质羟色胺、多巴胺的影响[J].中国行为医学科学,2004,13(2):127-128.