12-脂加氧酶抑制剂黄芩素对病毒性心肌炎小鼠动物模型的干预作用研究

韩 明,韩燕燕,刘仕成

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是儿科临床常见的心血管疾病，其发病有上升趋势，VMC可伴有心功能障碍或严重心律失常，并且已成为青少年不明原因猝死的主要原因之一，不仅如此，慢性VMC还可导致扩张性心肌病的发生，严重危害小儿生命健康。因VMC发病机制尚未完全阐明，至今国内外对VMC尚无特效的治疗方法。12-脂加氧酶(12-LO)是一类以非血红素铁蛋白为辅基的多功能酶，属于脂质酶家族中的一种，广泛分布于机体各部分，具有多种生物功能[1]。12-LO也是一种重要的信号分子，能够促进细胞增殖，通过机体氧化应激反应和炎症反应，参与了高血压、动脉粥样硬化等多种疾病的病理过程[2]。本研究旨在探讨12-LO抑制剂黄芩素对小鼠VMC发病的影响，为黄芩素治疗VMC的可行性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立[3]及实验分组 选取4周龄纯种近系BALB/C雄性小鼠250只，饲养于清洁级环境中，体质量(16±1) g，状态良好，活跃，饮食正常，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供。实验前称量小鼠的体质量并做记录，采用计算机随机分组的程序随机分成5组，每组50只。A 组：正常小鼠空白对照组，不给予病毒，每只小鼠腹腔注射0.9%氯化钠溶液0.1 ml；B组：模型组，每只小鼠腹腔注射10-2TCID50柯萨奇B3病毒(CVB3)0.1 ml，在腹腔注射病毒后2 h，每只腹腔注射0.9%氯化钠溶液0.1 ml；C组：高剂量治疗组，每只小鼠腹腔注射CVB3 0.1 ml，在腹腔注射病毒后2 h，每只腹腔注射0.4 g/L黄芩素溶液0.5 ml；D组：中剂量治疗组，每只小鼠腹腔注射CVB3 0.1 ml，在腹腔注射病毒后2 h，每只腹腔注射0.2 g/L黄芩素溶液0.5 ml；E组：低剂量治疗组，每只小鼠腹腔注射CVB3 0.1 ml，在腹腔注射病毒后2 h，每只腹腔注射0.1 g/L黄芩素溶液0.5 ml。以上小鼠腹腔注射CVB3共3 d，药物治疗连续21 d。分别于第4、7、14、21天随机取部分小鼠待用。

1.2 各组小鼠一般情况 A组50只小鼠未出现任何症状，无一例死亡。B组小鼠在接种病毒后第3天出现毛发松散、粗糙灰暗，不思饮食，稀便，行动迟缓，对刺激反应减退等症状，第4天有死亡，第7～14天是死亡的高峰，第14天后症状减轻。50只小鼠中有45只感染VMC，发病率为90%；21 d内共死亡14只，死亡率为28%。C、D、E组分别有44、47、46只小鼠感染VMC，发病率分别为88%、94%、92%。C组小鼠从病毒接种后21 d内共死亡1只，死亡率为2%。D组小鼠从病毒接种后21 d内共死亡6只，死亡率为12%。E组小鼠从病毒接种后21 d内共死亡8只，死亡率为16%。

1.3 心肌组织病理学检查 各组小鼠均于第4、7、14、21天随机抽取小鼠8只，拉颈脱臼处死。取小鼠心脏组织用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，常规苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察心肌组织的病理变化；并根据Rezkalla半定量分析法[4]计算心肌病变积分：即每张切片随机取5个高倍镜视野,计算炎性细胞浸润、心肌坏死面积占整个切片心肌面积的百分比。病理积分标准：无炎性细胞浸润、心肌坏死计0分，炎性细胞浸润、心肌坏死<25% 计1分，25%～50% 计2分，51%～75% 计3分，>75%计4分。

1.4 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测心肌组织中12 - LO mRNA的表达情况 按照RT-PCR一步法试剂盒说明书进行操作(RT-PCR试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司)。PCR反应条件：95 ℃预变性120 s，94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s， 循环35次，最后72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳，以DL-2000 作相对分子质量对照，同时各组均扩增β-actin作为内对照。引物序列：12-LO mRNA上游5′-ACTCCCATTGAGCCTAAA-3′，下游5′-GGAGCAACACCTTGGAAA-3′；内对照β-actin上游5′-CGTTGACATCCGTAAAGACAGG-3′，下游5′-TGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。扩增产物长度分别为12-LO mRNA 450 bp，β-actin 201 bp。扩增产物序列测序通过GenBank获得(通过primer 5.0设计，由大连宝生物有限公司合成)，并对数据进行半定量分析，用美国Pharmacia biotech公司凝胶成像分析系统扫描测定PCR产物电泳条带密度，按下列公式计算12-LO mRNA相对表达量，12-LO mRNA相对表达量=12-LO mRNA电泳条带密度/β-actin电泳条带密度。

1.5 血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平检测 小鼠眼眶采血，分离血清，应用Beckman-Coulter ACCESS微粒子全自动化学发光免疫分析仪检测 CVB3感染后的BALB/C小鼠血清CK-MB水平。

2 结果

2.1 各组小鼠心肌组织病理积分 5组小鼠各时间段的心肌组织病理积分比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中B组小鼠各时间段心肌组织病理积分均高于A 组,差异有统计学意义(P<0.01)；C、D、E组小鼠各时间段心肌组织病理积分均低于B组,差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table1 Comparison of myocardial tissue pathological score of mice in five groups at different time

组别只数第4天第7天第14天第21天A组80000B组8120±033▲303±046▲277±072▲110±049▲C组8077±023△154±061△089±056△043±031△D组8090±028△183±063△107±050△050±033△E组8108±035△213±074△124±061△067±042△F值2451379727641023P值<005<005<005<005

注：与A组比较，▲P<0.01；与B组比较，△P<0.05

2.2 各组小鼠血清CK-MB水平 B组小鼠CVB3接种后第4天CK-MB水平即有改变，第7～14天达到高峰，第21天降低。B组与A组相比，第4、7、14天血清CK-MB水平差异具有统计学意义(P<0.05)。C、D、E组小鼠第4、7、14天的血清CK-MB水平与B组相应时间段比较均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，但仍未降到正常水平，见表2。

Table2 Comparison of serum CK - MB level of mice in five groups at different time

组别只数第4天第7天第14天第21天A组8121±107 131±102 114±103 102±110B组8374±155▲598±236▲484±171▲263±237C组8305±124△371±212△347±101△237±204D组8346±156△544±245△434±122△242±211E组8351±136△528±241△427±178△253±216F值451890627088P值<005<005<005>005

注：与A组比较，▲P<0.01；与B组比较，△P<0.05

2.3 各组小鼠心肌组织12-LO mRNA相对表达量 不同时间段各组小鼠心肌组织12-LO mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)。B组小鼠各时间段心肌12-LO mRNA相对表达量均高于A 组，差异有统计学意义(P<0.01)； C、D、E组小鼠心肌组织12-LO mRNA相对表达量除第4天外，其他各时间点的表达量均低于B组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。注药第7天各组小鼠心肌组织中均有12-LO mRNA的表达，其中A组小鼠心肌组织12-LO mRNA低表达， B组小鼠心肌组织12-LO mRNA高表达， C、D、E组小鼠心肌组织中12-LO mRNA的表达均低于B组(见图1)。

2.4 12-LO mRNA表达量与心肌组织病理积分的关系 C、D、E组小鼠12-LO mRNA表达量与心肌组织病理积分均呈正相关(C组：r=0.892，P<0.01；D组：r=0.520，P<0.05；E组：r=0.364，P<0.05)。

Table3 Comparison of 12-LO mRNA in myocardial tissue in five groups at different time

组别只数第4天第7天第14天第21天A组80109±0013 0113±0021 0121±0023 0117±0019 B组80623±0321▲1311±0208▲1018±0302▲0512±0025▲C组80578±0332 0789±0211△0667±0236△0413±0089△D组80611±0267 0945±0247△0784±0345△0473±0113△E组80619±0257 1109±0301△0855±0349△0591±0101△F值571415234831205P值<005<005<005<005

注：与A组比较，▲P<0.01；与B组比较，△P<0.05

注：1为DL-2000 Marker，2为A组，3为B组，4为C组，5为D组，6为E组，7为阴性对照组

图1 RT-PCR检测心肌12-LO电泳结果

Figure1 The agarose gel electrophoresis results of 12-LO of mice myocardial tissue detected by RT-PCR

2.5 12-LO mRNA表达量与血清CK-MB水平的关系 C、D、E组小鼠心肌组织12-LO mRNA表达量与血清CK-MB水平均呈正相关(C组：r=0.906，P<0.05；D组：r=0.492，P<0.05；E组：r=0.327，P<0.05)。

3 讨论

通过CVB3感染BALB/C小鼠来诱发VMC，是构建CVB3 VMC模型的经典方法。VMC基本病理改变是心肌间质的炎性细胞浸润和心肌细胞的变性、坏死以及晚期出现纤维化改变等，本实验中心肌组织病理学检查结果显示空白对照组各期小鼠心肌组织均无病理变化，心肌肌纤维分布正常；模型组小鼠各时间段的心肌组织符合VMC的病理变化。另外，小鼠血清心肌酶的改变可作为心肌细胞损伤的标志之一。临床上常检测的心肌酶指标包括乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)、肌酸激酶(CK)、CK-MB。其中CK-MB是CK的同工酶之一，CK-MB大量存在于心肌组织中，在骨骼肌等组织内也有少量存在，是心肌受损的急性期诊断指标。本实验目的在于观察小鼠在病毒接种后所发生心肌损害的动态变化，所以在评价心肌坏死的范围及过程时检测了CK-MB；结果显示，模型组小鼠血清CK-MB水平在第4天时即开始升高,在第7天时明显升高，并达到高峰，以后略有下降，第21天下降明显，提示在CVB3感染初期小鼠心肌即出现损伤，有不同程度的炎性病变，而在CVB3感染后期该指标有所下降，说明心肌可能出现一定程度的修复。经12-LO抑制剂黄芩素治疗的各组小鼠与模型组比较，各时间点小鼠心肌组织病理积分均减少，血清CK-MB水平降低(第21天除外)，提示黄芩素可减轻VMC病情。

近年来对12-LO的研究较多，其为重要的信号分子[5]，生长因子、细胞因子以及高糖均能刺激血管平滑肌细胞、单核细胞的12-LO 表达上调，大鼠颈动脉气囊损伤后损伤区12-LO表达明显增加，而且12-LO还参与了氧化应激和过氧化物的形成，抑制动脉硬化程度。目前把心肌炎和12-LO联系在一起的文献很少，本实验通过RT-PCR半定量分析发现，空白对照组小鼠心肌组织12-LO mRNA呈现低表达量，模型组小鼠心肌组织12-LO mRNA表达量较空白对照组明显增高，病毒感染后第4天12-LO mRNA表达开始升高，之后逐渐增高，第7～14天达高峰，而后随时间的延长而略有下降，但仍维持在一个较高水平，提示CVB3病毒感染后14 d内小鼠心肌组织中12-LO的表达呈时间依赖性。说明12-LO参与VMC的发生和发展。本实验结果还显示心肌组织病理积分和血清CK-MB水平与12-LO mRNA 表达量之间呈正相关关系，在一定程度上反映了VMC小鼠病情严重程度，提示12-LO的高表达可导致心肌损伤，且与VMC的病理过程密切相关。据此推测12-LO可能成为VMC治疗的一个潜在的、有价值的靶点。

12-LO抑制剂黄芩素因其具有特异的作用靶点和良好的实验研究效果，有学者对其治疗疾病的机制进行了研究[6]。黄芩素不仅具有多种药理活性，也是12-LO的特异性抑制剂，在由12-LO介导的疾病中发挥着积极作用[7-8]。本实验结果表明，不同剂量的黄芩素均能有效降低小鼠心肌组织12-LO表达量，提示特异性12-LO抑制剂黄芩素对小鼠VMC具有一定的治疗效果，通过干预12-LO的作用，可能会减轻VMC的心肌病理损害程度。由此推测黄芩素治疗VMC的可能机制是通过抑制12-LO，减轻氧化应激反应，改善小鼠心肌组织的病理变化，保护心肌细胞，为开发治疗VMC的新药提供了实验依据。

1 Dobrian AD，Lieb DC，Cole BK，et al.Functional and pathological roles of the 12- and 15-lipoxygenases[J].Prog Lipid Res ，2011，50(1)：115-131.

2 蒋丽萍，陆阳，陈红专.脂加氧酶及其抑制剂研究进展[J].中国药理学通报，2005，21(8)：897-901.

3 邓婕，邓玉莲，许春萱，等.心肌炎动物模型：CoxB3感染BALB/c小鼠心肌炎[J].中国人兽共患病杂志，2001,17(6)：86-88.

4 Rezkalla S,Kloner RA,Khatib G，et al.Effect of metoprolol in acute coxsaekievinm B3 murine myoearditi[J].J Am Coll Cardiol，1988，12(2)：412-414.

5 Minamino T.Role of 12/15 lipoxygenase-induced inflammation in heart failure[J].Nihon Yakurigaku Zasshi,2011，138(5):187-191.

6 王雪峰,刘芳,谢彬,等.不同提取方法的黄芩制剂体外抗柯萨奇病毒B3m和保护细胞作用的比较研究[J].中国药学杂志，2006,41(23):1788-1791.

7 徐红芳.中药黄芩的临床配伍应用及现代研究[J].中国中医药杂志，2008，5(11)：41.

8 许文杰，丁启龙.黄芩素的药理学研究进展[J].江苏药学与临床研究，2006，14(2)：35-39.