胸腺五肽联合比索洛尔对免疫介导大鼠扩张型心肌病的干预研究*

李鹏，贾志梅，马春燕，谢成耀，刘军，贾志军

胸腺五肽联合比索洛尔对免疫介导大鼠扩张型心肌病的干预研究*

李鹏，贾志梅，马春燕，谢成耀，刘军，贾志军

目的：观察胸腺五肽联合比索洛尔对免疫介导的扩张型心肌病（DCM）大鼠心脏结构及功能的干预作用，并探讨其机制。

扩张型心肌病；T 淋巴细胞亚群；胸腺五肽；比索洛尔

免疫功能的变化在扩张型心肌病（DCM），的病情发展进程中可能起重要的介导作用，免疫功能异常的持续存在会对心肌进行不断的损伤，使得疾病持续进展。胸腺五肽是人工合成的五肽，具有与胸腺生成素相似的生物活性，对机体的免疫功能具有双向调节作用。本实验探讨胸腺五肽联合比索洛尔对自身免疫性DCM大鼠心脏结构及功能的干预作用及可能的作用机制。

1 材料与方法

实验动物及制剂：实验起止时间为 2009-11 至2011-12。 无 特 定 病 原 体 级 Lewis 大 鼠 [北 京 维 通利华实验动物技术有限公司动物质量合格证编号：SCXK(京 )2006-009]，6 周龄，体重 200～250g，雄性，饲养于中国医科大学动物部 SPF 级动物实验室 [动物饲养合格证编号：SYXK(辽 )2008-0005]。纯化的猪心肌球蛋白和弗氏完全佐剂均购自美国 Sigma 公司。

自身免疫性 DCM 大鼠模型的建立及分组：按操作程序成功建立自身免疫性 DCM 大鼠模型[1，2]，免 疫 28 天 后[3，4]， 将 存 活 的 45 只 Lweis 大 鼠 区 组随机分为 3 个实验组（n=15）：即生理盐水组：给适量生理盐水；比索洛尔治疗组：给富马酸比索洛尔（6.65mg/kg，日 1 次，灌胃）治疗；胸腺五肽联合富马酸比索洛尔治疗组（联合治疗组）：给胸腺五肽（0.14 mg/kg，日 1 次，腹腔注射 ）联合富马酸比索洛尔（6.65 mg/kg，日 1 次，灌胃 ）。另取同龄 Lewis 大鼠作为空白对照组（n=15）。

标本的采集和处理：用药28天后各组大鼠均随机取10只进行心脏超声及血流动力学检查。检查完毕后，股静脉注入 2～3 ml 10% 氯化钾，使心室停搏于舒张期，迅速下腔静脉取血，一部分血用大鼠淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，进行T淋巴细胞亚群的检测，一部分血离心（3000 转 / min，10 min），收集血清，-20℃保存备用。取血后迅速开胸切取心脏，用预冷生理盐水冲洗后，去除心房、大血管及心脏外结缔组织等，无菌纱布吸干水分，用于行心脏重塑指标检查。

T 淋巴细胞亚群的检测：取外周血 2ml，肝素抗凝，用生理盐水将血稀释成 4ml，混匀。将稀释后的血液沿试管壁徐徐加入 4ml淋巴细胞分离液Ficoll到液面之上。离心 2000 r/min，30 min，室温18～20℃，离心后可见试管内的血液清楚的分为4层，上层为血浆层，第二层为分离液层（单个核细胞处于血浆层和分离液层中间），第三层为粒细胞层，底层为红细胞层。用吸管将上二层间的单个核细胞层吸出收集到另一试管，用生理盐水洗2遍，每次均以 1500 r/min，离心 10 min，弃上清后即可得到高纯度的单个核细胞悬液。加入藻红蛋白（PE）标记的抗大鼠簇分化抗原（CD）4、多甲藻黄素叶绿素蛋白标记的抗大鼠 CD8、异硫氰酸荧光素 标记的抗大鼠 CD3，室温孵育 30 min 后，经流式细胞仪检测。

心脏超声及血流动力学检测：大鼠术前称重并麻醉（戊巴比妥钠 20～35 mg/kg）。麻醉完全后，将大鼠胸前及大腿内侧去毛，应用 Agilent sonos 5500 超声检测仪，采用 11 - 3L 探头，经胸进行心脏超声检查，在左心室腱索中部水平获得清晰的 M - 型超声图像，测量左心室舒张末期内径（ LVIDd ）、左心室收缩末期内径（ LVISd）、室间隔厚度、左心室后壁厚度、射血分数（EF）。心脏彩超检查完毕后，将大鼠仰面固定，剪开颈部皮肤，止血钳顿性分离颈部皮肤，分离右侧颈总动脉及颈内静脉，结扎远心端，穿刺插入 20 G 静脉小鞘管，经压力换能器连接至正华 MD 3000生物信号采集系统，记录大鼠 中心静脉压 ( CVP)、平均血压、左心室舒张期末压 (LVEDP) 、等容期内左心室压力最大变化速率 ( ±dp /dt) 。

心脏重塑指标的测定：将切取的心脏用电子天平（精确到 0.001 g）称取心脏重量（HW）。用直接测量法测量左心室长轴长度（L），左心室短轴长度（D），两者之比为球形指数。将心肌组织于 4% 多聚甲醛溶液中固定保存 24h 后，经石蜡包埋，每个大鼠按顺序取第二张 5μm 石蜡切片， 苏木素 - 伊红染色法过程染色，在放大10倍下获取包括整个左心室截面的切片图像，用计算机图像分析系统测定每张切片上左心室截面最长径（Dmax）及最短径（Dmin），计算左心室截面直径=（左心室截面最长径×左心室截面最短径 ）1/2。

血清细胞因子水平的检查： -20℃取出血清，酶联免疫吸附法检测血清白介素 -10 及干扰素 -г 的含量，操作步骤按照说明书进行。

统计分析：计量资料采用x±s表示，统计学处理均采用 SPSS 17.0 软件进行分析，单因素两组以上的均数间差异比较用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

各组大鼠T淋巴细胞亚群检测结果的比较：治疗28 天后， 3 个实验组与空白对照组相比，CD4 、CD4/ CD8比值均增高，CD8下降。联合治疗组与生理盐水组和比索洛尔组相比， CD4 及 CD4/CD8 比值均降低，CD8增多。上述比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。表1

表1 各组 T 淋巴细胞亚群检测结果和血清细胞因子水平的比较

表1 各组 T 淋巴细胞亚群检测结果和血清细胞因子水平的比较

注：与空白对照组比较：*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ；与生理盐水组比较：∆P ＜0.05 ∆∆P ＜ 0.01；与比索洛尔组比较：▲P ＜ 0.05▲▲P ＜ 0.01。 CD：簇分化抗原

组别 空白对照组 生理盐水组 比索洛尔治疗组 联合治疗组T淋巴细胞亚群C D 4（%） 4 0 . 1 2 ± 2 . 9 3 4 4 . 7 1 ± 0 . 3 1* 4 3 . 9 8 ± 0 . 6 5* 4 1 . 9 8 ± 2 . 3 4*∆▲C D 8（%） 1 9 . 7 8 ± 3 . 7 4 1 6 . 7 6 ± 3 . 9 8* 1 7 . 1 4 ± 0 . 1 6* 1 8 . 2 7 ± 1 . 3 3*∆▲C D 4 / C D 8 2 . 0 2 ± 0 . 0 5 2 . 6 9 ± 0 . 2 1* 2 . 6 0 ± 0 . 1 3* 2 . 0 9 ± 0 . 1 4*∆▲干扰素 -г ( n g / L ) 1 . 8 9 ± 0 . 0 3 1 5 . 8 9 ± 0 . 3 0** 1 3 . 7 4 ± 0 . 1 9** 6 . 9 3 ± 0 . 0 6**∆∆▲▲血清白介素 -1 0 ( n g / L ) 1 . 6 8 ± 0 . 1 1 5 . 9 3 ± 0 . 2 8** 6 . 3 2 ± 0 . 0 7** 1 1 . 3 1 ± 0 . 5 8**∆∆▲▲

各组大鼠超声心动图检测指标的比较：治疗28天后，生理盐水组和比索洛尔组与空白对照组相比，左心室舒张末期内径、左心室收缩末期内径均增大，室间隔厚度、左心室后壁厚度均缩小 ，生理盐水组射血分数降低。比索洛尔治疗组与生理盐水组相比，左心室收缩末期内径缩小，射血分数升高。联合治疗组与生理盐水组和比索洛尔组相比，左心室舒张末期内径、左心室收缩末期内径均缩小，室间隔厚度、左心室后壁厚度均增大。联合治疗组较生理盐水组的射血分数升高。上述比较差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。表2

表2 各组大鼠超声心动图指标、血流动力学检测指标及心脏重塑指标的比较 （n=10，±s）

各组血流动力学检测指标的比较：治疗 28天后，生理盐水组、比索洛尔组与空白对照组比较，心脏重量 /体重、中心静脉压水平及 LVEDP 均显著升高，平均血压和等容期内左心室压力最大变化速率均显著降低。与生理盐水组比较，比索洛尔组中心静脉压水平及 LVEDP 降低。联合治疗组与生理盐水组和比索洛尔组比较，心脏重量/体重、中心静脉压水平及 LVEDP均降低，平均血压和等容期内左心室压力最大变化速率均升高。上述比较差异均有统计学意义（P＜0.05～0.01）。 表2

各组大鼠心脏重塑指标的比较：治疗 28天后，生理盐水组和比索洛尔组与空白对照组相比，左心室长轴、左心室短轴及左心室截面直径均增大，球形指数减小。联合治疗组与生理盐水组和比索洛尔组相比，左心室长轴、左心室短轴及左心室截面直径均减小，球形指数增加。比索洛尔组与生理盐水组比较，左心室截面直径减小。上述比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。表2

各组血清细胞因子水平的比较：治疗 28 天后，3 个实验组与空白对照组相比，白介素 -10 及干扰素 -г 均显著增高（P＜0.01）。 联合治疗组与生理盐水组和比索洛尔组比较，血清白介素 -10 水平增高，干扰素-г水平均降低。上述比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。表1

各组大鼠心脏病理组织学的测定结果：空白对照组大鼠没有发现炎细胞浸润及心肌细胞坏死；生理盐水组大鼠心肌 HE染色，心肌组织出现广泛炎性细胞浸润，主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及多核巨细胞，肌纤维排列紊乱，肌浆溶解，伴有心肌坏死区域。比索洛尔治疗组与联合治疗组大鼠心肌的上述观察指标数量减少，程度降低。图1

图1 各组大鼠心脏病理组织学的测定结果 （n=10 ） HE 染色 × 20 1A：对照组 1B：生理盐水组 1C：比索洛尔治疗组 1D：联合治疗组

3 讨论

DCM 的 发 病 与 免 疫 系 统 状 态 异 常 有 关[5，6]，因此，从发病机制角度出发，调节免疫功能应该有益于心功能的改善。本研究发现，胸腺五肽联合比索洛尔治疗后，各项检测指标较单用比索洛尔治疗改善更加明显，表现为左心室内径减小，室壁厚度增加，球形指数及射血分数提高，以及血流动力学改善。说明胸腺五肽联合比索洛尔较单用比索洛尔治疗能更明显的改善 DCM 大鼠心脏的结构和功能。

CD4+T/ CD8+T 是 T 细 胞 的 主 要 表 面 标 志，表达 CD4+ 的主要是辅助性 T 细胞（Th），表达CD8 的主要是细胞毒性 T 细胞（CTL）。目前认为，CD4+ T 细胞是启动心肌炎必需的，而且被认为是疾 病 进展的 标 志[7]。Th 根据 其 所分 泌 的细 胞 因子及功能的不同划分为三种亚群：Th0、Th1、Th2。Th1 主要表达白介素 -2 和干扰素 -г，介导细胞免疫；Th2 主要表达白介素 -4、白介素 -6 和白介素 -10，辅助体液免疫。白介素 -10 是已知的具有抗炎、抑制免疫活性的 II型细胞因子，有研究发现，白介素 -10 的表达能够显著减少心肌炎症及 纤 维 化， 并 且增 加 射 血分 数[8]；Th0 可在 不 同的信号刺激下分化为 Th1 或 Th2。当 Th1、Th2 失平衡时，意味着免疫自稳状态被破坏，而通过检测细胞因子干扰素 -г、白介素 -10 水平，可以反映Th1、Th2 的平衡状态。本实验显示与空白对照组相比，生理盐水组的白介素 -10 及干扰素 -г 均显著增高，CD4 及 CD4/CD8 显著升高，CD8 显著降低，提示 DCM 大鼠存在免疫失衡状态。治疗后，与生理盐水组相比，联合治疗组的血清干扰素-г水平显著降低，白介素 -10 水平显著增高，同时CD4/CD8 趋于正常化，表明胸腺五肽可逆转 Th1、Th2 失衡，调整免疫状态，从而抑制对心肌的损害。其可能的机制是通过抑制 Th1 细胞增殖、抑制 Th1分泌的炎性细胞因子、促使 Th2 活化和诱导 Th2分泌抗炎性细胞因子，从而减少 Th1 类细胞因子的分泌，刺激 Th2 类细胞因子的产生。该研究结果与文献报告是一致的[9]。

[1]Kodama M，Matsumoto Y，Fujiwara M，et al. A novel experimental model of giant cell myocarditis induced in rats by immuniazation with cardiac myosin fraction.Clin Immunol Immunopathol,1990，57:250-262.

[2]Inomata T，Hanawa H，Miyanishi T，et al.Localization of porcine cardiac myosin epitopes that induce experimental autoimmune myocarditis.Circ Res，1995，76:726-733.

[3]Gavrilova SA，Morozova MP，Kniazhentseva AK，et al. Dynamics of autoimmune myocarditis development in rats. Izv Akad Nauk Ser Biol，2010， 597-609.

[4]Cunningham MW.Cardiac myosin andthe TH1/TH2 paradigm in autoimmune myocarditis. Am J Pathol, 2001，159:5-12.

[5]秦玲，井玲，郑杨 .扩张型心肌病与免疫因素关系的研究 .中国循环杂志，2001,16:193-194.

[6]丁建东，吴翔，顾勇 .抗人心肌线粒体抗体在病毒性心肌炎和扩张型心肌病中的检测及其意义 . 中国循环杂志，2001,16:38-40.

[7]Haasken S，Auger JL，Binstadt BA. Absence of β2 integrins impairs regulatory T cells and exacerbates CD4+ T cell-dependent autoimmune carditis. J Immunol，2011，187:2702-2710.

[8]Kaya Z， Leib C， Werfe S，et al. Comparison of IL-10 and MCP-1-7ND gene transfer with AAV9 vectors for protection from murine autoimmune myocarditis. Cardiovascular Res，2011，9:116-123.

[9]Liu W，Li WM， Gao C，et al.Effects of atorvastatin on the Th1/Th2 Polarization of ongoing experimental autoimmune myocarditis in Lewis rats.J Autoimmun， 2005，25:258-263.

The Interventional Effect of Thymopentin Combining With Bisoprolol in Dilated Cardiomyopathy Rats With Immune-Induction

LI Peng, JIA Zhi-mei, MA Chun-yan, XIE Cheng-yao, LIU Jun, JIA Zhi-jun.

Department of Cardiology，First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang (110001), Liaoning, China

Corresponding Author: JIA Zhi-mei, Email: jia20060101@sogou.com

Objective: To observe the interventional effect of thymopentin combining with bisoprolol on cardiac structure and function in dilated cardiomyopath (DCM) rats with immune-induction.Methods: A total of 45 DCM rats with immune-induction model were divided into 3 groups, Experimental control group, the rats were treated with normal saline, Bisoprolol group, and Thymopentin with bisoprolol group, n=15 in each group. In addition, there was a Blank control group with 15 normal rats. All animals were treated for 28 days. The T-lymphocyte subsets, cardiac echocardiography, ventricular remodeling index and the serum levels of cytokine were examined in 10 randomly selected rats from each group and compared among different groups.Results: Compared with Experimental control group and Bisoprolol group, the Thymopentin with bisoprolol group showed decreased serum level of CD4/CD8 and increased CD8; decreased left ventricular end-diastolic dimension (LVEDD) and LVESD, increased thickness of ventricular septal; decreased cardiac weight/body weight, central vein pressure and LVED pressure; reduced left ventricular long-axis, minor-axis and cross section diameter, enlarged left ventricular spherical index; the increased serum level of IL-10 and decreased IFN-г; P＜0.05～0.01 respectively.Conclusion: In DCM rats with immune-dysfunction, the treatment of thymopentin combining with bisoprolol could improve the left ventricular remodeling and function, the effect was superior to bisoprolol alone. The mechanism of thymopentin might be because of inducing and promoting T-lymphocyte’s differentiation, maturation and activation.

Dilated Cardiomyopathy; T-lymphocyte subsets; Thymopentin; Bisoprolol (Chinese Circulation Journal, 2013,28: 230.)

2012-06-25）

(助理编辑：曹洪红)

*

辽宁省教育厅 2009 年度高等学校科研项目（2009A740）

110001 辽宁省沈阳市，中国医科大学附属第一医院 心内科（李鹏、贾志梅 ），超声科（马春燕 ）;中国医科大学病理教研室

（谢成耀 ）,免疫教研室（刘军 ）;广西南宁武鸣县人民医院 急诊科（贾志军 ）

李鹏 硕士研究生 主要从事冠心病与心力衰竭的研究 Email:skywalker1986@163.com 通讯作者 :贾志梅 Email:jia20060101@sogou.com

R541

A

1000-3614（2013）03-0230-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.03.020

方法：以纯化的猪心肌球蛋白与弗式完全佐剂乳化后的混合液皮下免疫 Lewis 大鼠建立自身免疫性 DCM 模型，45 只 DCM 大鼠，随机分为 3 组（每组n=15）：生理盐水组、比索洛尔治疗组及胸腺五肽联合富马酸比索洛尔治疗组（联合治疗组 ），另选同龄 Lewis 大鼠作为空白对照组（n=15）。用药 28 天后各组大鼠均随机取 10 只进行 T 淋巴细胞亚群、心脏超声、心脏重塑指标、血流动力学及血清细胞因子水平的检查。

结果：28 天治疗后，与生理盐水组和比索洛尔治疗组比较：联合治疗组簇分化抗原（CD）4 和 CD4/CD8 比值降低 ，CD8 增加；左心室舒张末期内径和左心室收缩末期内径均缩小，室间隔厚度和左心室后壁厚度均增大；心脏重量 /体重、中心静脉压水平及左心室舒张期末压均降低，平均血压及等容期内左心室压力最大变化速率均升高；左心室长轴、左心室短轴及左心室截面直径均减小，球形指数增大；血清白介素 -10 水平增高，干扰素 -г 水平降低，上述比较差异均有统计学意义（P＜0.05～0.01）。

结论：DCM 大鼠存在免疫功能紊乱；胸腺五肽联合比索洛尔改善 DCM 大鼠左心室重构和功能的作用优于比索洛尔单药治疗；胸腺五肽的作用机制可能为诱导和促进T淋巴细胞及其亚群的分化、成熟和活化。