壳聚糖 /肝素雷帕霉素药物洗脱支架对猪冠状动脉早期快速内皮化及抗血栓的作用*

郜俊清，金惠根，严鹏勇，张文全，武前福，刘宗军

·基础与实验研究·

壳聚糖 /肝素雷帕霉素药物洗脱支架对猪冠状动脉早期快速内皮化及抗血栓的作用*

郜俊清，金惠根，严鹏勇，张文全，武前福，刘宗军

目的：明确壳聚糖 /肝素雷帕霉素药物洗脱支架（LBL-PLA-RAP 支架）对猪冠状动脉（冠脉）早期快速内皮化及抗血栓的作用。

药物洗脱支架；层层自组装；壳聚糖 /肝素；内皮化；血栓；

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:218.)

药物洗脱支架可显著降低冠状动脉（冠脉）介入治疗再狭窄率的发生，但是支架内皮化不良、支架晚期血栓形成是经皮冠脉介入术的突出问题[1-3]。有研究表明，药物洗脱支架置入后可出现支架内血栓、聚合物高敏反应、支架贴壁不良、动脉瘤等并发症[4-6]，而支架内血栓尤其是晚期支架内血栓是药物洗脱支架最严重的并发症，已引起国内外学者的高度重视。研究显示，目前临床应用的主要药物洗脱支架 (如雷帕霉素和紫杉醇洗脱支架 )在置入血管后存在支架内皮化延迟，并可能是晚期支架内血栓形成的主要原因[7-10]。目前改善药物洗脱支架早期内皮化的方法仍主要为药物洗脱支架涂层膜的改性及所载物质的选择[11-15]。本课题组在前期研究[16]中成功地将壳聚糖/肝素层层自组装涂层膜应用于裸金属支架表面，并表现出强大的抗血栓及促进早期内皮化作用，该涂层膜是自主研发研究结果，已形成发明专利（专利号：200710045639.1）。本次研究是将壳聚糖/肝素层层自组装涂层膜应用于雷帕霉素药物洗脱支架中，望研究出一种具备抗血栓及促进早期内皮化安全有效的药物洗脱支架。

1 资料与方法

壳聚糖 /肝素雷帕霉素药物洗脱支架（LBLPLA-RAP 支架 ）的制备：将 316 L 不锈钢冠脉金属裸支架（18 mm×2.5 mm～3 mm）（微创医疗器械有限公司提供，中国 ）沉浸在酒精 /水（1:1）中作用 4 h，以除去油性污垢，然后用去离子水清洗，30℃减压烘干 24 h。将清洗后的裸金属支架沉浸在 3- 氨丙基乙醇溶液（购自 Acros Organics 公司，比利时 ）4 h，然后用去离子水清洗，50℃常压烘干清洗后的裸金属支架沉浸在一个含 0.1%乙醇的3 - 氨丙基溶液（APTES，购自 Acros Organics 公司，比利时）中 37℃ 4 h，然后用去离子水冲洗，并在50℃空气干燥。经处理的支架置入 0.01 M 盐酸中 2 h，再用大量的水冲洗。然后，将支架浸泡在 0.1%肝素钠盐水溶液（高能物理研究化工有限公司）15 min，随后用纯净水冲洗。随后将肝素支架置入 0.2% 乙酸与 0.1% 壳聚糖（购自西格玛公司 ）混合溶液中 15 min，再次进行漂洗。反复进行上述涂层沉积，产生一个稳定静电相互吸引作用的复合膜。最后将壳聚糖肝素支架于 30℃减压烘干 48 小时，制备成壳聚糖 /肝素涂层膜支架（LBL 支架），该支架为自主研发，已形成发明专利（专利号：200710045639.1）。将聚乳酸与雷帕霉素 1:1 混合，将壳聚糖 /肝素涂层膜支架采用滚涂法涂抹于支架外表面，以直径每cm 支架 50 μg 雷帕霉素药物含量均匀涂抹于支架表面，制备成非对称型 LBL-PLA-RAP 支架（血液面为壳聚糖/肝素涂层，血管壁面为聚乳酸与雷帕霉素），最后以 30℃减压烘干 48 h。

实验动物及术前准备：所有动物实验经上海中医药大学动物保护利用委员会批准。实验动物为广西小香猪 9只（25公斤，6月龄，于2010-12 购自上海动物管理中心）。所有动物进行常规饲料喂养，其中 6 只每天给予 300 mg 阿司匹林及 150 mg 氯吡格雷抗血小板聚集，另外3只不给与抗血小板药物干预。动物实验前一夜禁食，采用 0.5 mg/kg 氯胺酮及 0.5 mg/kg 地西泮诱导麻醉，气管插管保持气道通畅，采用戊巴比妥钠静脉麻醉。

动静脉分流模型：本实验猪均经阿司匹林及氯吡格雷抗血栓作用。无菌条件下，分离猪股动脉及股静脉，采用消毒后的 30 cm×3 mm皮管链接动静脉，形成动脉静脉循环，将 LBLPLA-RAP 支架、LBL 支架与裸金属支架于皮管内扩张，每种支架重复3个样本，使用3只小香猪进行实验，每只小香猪中放入不同组的3个支架，每支血管置入1枚支架，将血液灌流，血流控制在 90 ml/ min，灌流 60 min，隔开管道，取出支架，所有样品经干燥进行称重、光镜比较。

高血栓负荷模型：本实验猪未经阿司匹林及氯吡格雷抗血栓作用。将 LBL-PLA-RAP 支架、LBL 支架与裸金属支架经 12 个大气压进行扩张置入猪冠脉，每种支架重复3个样本，使用3只小香猪进行实验，每只小香猪中放入不同组的3个支架，每支血管置入1枚支架，根据心电图 ST 段变化及每相隔 10 min 进行冠脉造影，并通过血管内超声明确血栓形成，观察比较不同支架形成血栓的时间。

球囊损伤模型：本实验猪均经阿司匹林及氯吡格雷抗血栓作用。从股动脉途径进行冠脉造影，通过定量冠脉造影选取冠脉直径在 2.5～3.5 mm 的血管，随机选取支架，通过 0.014 导丝将支架置入冠脉，以球囊扩张，平均 12个大气压，扩张 8 秒，扩张比例以扩张直径：血管直径 1.1:1的比例进行过度扩张，缓慢撤出球囊，重复冠脉造影，然后缓慢撤出导管，股动脉修复，缝合皮肤。使用3只小香猪进行实验，每只小香猪中放入不同组的 3 个支架（LBL-PLA-RAP 支架、LBL 支架、裸金属支架），每支血管置入 1 枚支架，所有猪术后每日服用阿司匹林 300 mg 及氯吡格雷 150 mg 抗血小板治疗，1 周后复查冠脉造影。

组织制备：冠脉支架于第7天取出，每个支架被平均切成 3 段。1 段经 10% 缓冲福尔马林固定后，硬树脂包埋，再经硬组织切片机切片（德国莱卡切片机），经苏木素伊红染色，测定血管面积及组织学分析。1段经 1% 戊二醛固定，样本经冷冻干燥，采用扫描电子显微镜观察（扫描电镜，TS 5136 MM, Tescan Ltd.）。另 1 段经免疫组化固定液固定（购自碧云天公司），通过 CD31 免疫荧光抗体（购自 Abcam 公司）进行免疫组化，通过激光共聚焦（购自 LEICA 公司）观察冠脉支架。

统计学分析：所有数据采用 SPSS17.0 软件进行统计分析。若P＜0.05 则认为数据间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动静脉分流实验

所有的裸金属支架在不足1小时出现支架内血流堵塞，而所有的 LBL-PLA-RAP 支架管腔内仍保持通畅。取出支架，用磷酸盐缓冲液轻柔冲洗支架，50℃常压烘干，见裸金属支架表面满覆血栓，而LBL-PLA-RAP 支架表面基本无血栓。称重，LBLPLA-RAP 支 架血 栓重量为（0.40±0.11）mg，LBL支架血栓重量为（0.46±0.06）mg，比裸金属支架血栓重量（9.46±2.75）mg 均低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表1

表1 三种支架在动静脉分流模型、高血栓负荷模型及 CD31 荧光染色定量分析中的比较（±s）

2.2 高血栓负荷实验

裸金属支架在（59.0±8.5）min 出现支架血栓，与 LBL-PLA-RAP 支架和 LBL 支架在 360 min 内未出现支架血栓比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表1

2.3 球囊损伤实验

在置入支架后的第7天，复查冠脉造影，各组均无支架内再狭窄发生。处死实验猪，取出支架段冠脉，横断面切片经苏木素伊红染色后，LBLPLA-RAP 支架、LBL 支架与裸金属支架均无狭窄发生，也无明显内皮剥脱现象（图1A、1B、1C）。

图1 支架段冠脉横断面切片图片。1A：LBL-PLA-RAP 支架 1B：LBL 支架 1C：裸金属支架

另取一段经戊二醛固定后，扫描电镜观察支架内皮化，裸金属支架表面已经内皮化（图2 C），但 1000 倍扫描电镜显示内皮细胞呈圆形生长，而LBL-PLA-PAR 支架（图2 A）与 LBL 支架（图2B）表面已经完全内皮化，1000 倍扫描电镜显示内皮细胞呈梭形顺血流方向生长。

图2 电镜观察支架 内 皮化图片。2A：LBL-PLA-RAP 支架 2B：LBL 支架2C：裸金属支架

获取冠脉支架后另取一段冠脉支架，将支架浸泡于专用免疫组化固定液（购自碧云天公司）中，剪开并平铺支架，用 CD31 抗体对支架进行免疫荧光染色，采用激光共聚焦检测，Image-Pro Plus 6.0 软件进行定量分析，结果显示 LBL-PLA-RAP 支架内皮覆盖率为（82.7±16.4）%(图3A)，LBL 支架内皮覆盖率为（80.7±14.1）%(图3B)，比裸金属支架内皮覆盖率（64.3±11.0）%(图3C)均高，差异均有统计学差异（P＜0.05）。表1

图3 免疫荧光染色图片。3A：LBL-PLA-RAP 支架 3B：LBL 支架 3C：裸金属支架

3 讨论

在本次研究中，我们首次采用支架双面不对称涂层法将壳聚糖/肝素涂层膜应用于雷帕霉素药物洗脱支架。滚涂法涂层与一般喷涂法比较，可将支架进行单面涂层，达到支架血液表面与组织表面功能性的差异。本研究通过涂层膜对于内皮的“高亲和力”，达到早期促进内皮化，抗血栓生成的效果。支架的内皮修复是血管修复的关键一步，支架表面内皮早期迁移修复可以有效降低血栓的形成。

LBL-PLA-RAP 支架在体外动静脉分流模型中，LBL-PLA-RAP 支架与 LBL 支架具有相似的抗血栓作用，2 h 内，支架表面几乎没有支架血栓粘附，而裸金属支架表面满布血栓。在高负荷体内血栓模型（在未经氯吡格雷及阿司匹林抗血小板聚集的实验猪）实验中，LBL-PLA-RAP 支架与 LBL 支架在置入支架后 360 min 内未出现支架血栓表现，而裸金属支架在 59 min 时就出现支架血栓。该实验更符合人体支架血栓形成的规律，进一步明确 LBL-PLARAP支架具有良好的抗血栓作用。

在1周的整体动物模型中，三种支架均未出现再狭窄，且没有明显的炎症改变，而让人感到高兴的是，LBL-PLA-RAP 支架在 1 周时就已经几乎完全内皮化，扫描电镜结果显示 LBL-PLA-RAP 支架表面已经覆盖了一层梭形顺血流方向生长的内皮细胞，而裸金属支架虽也已覆盖了内皮细胞，但是细胞形态仍略劣于 LBL-PLA-RAP 支架。本研究，采用激光共聚焦检测，支架表面内皮细胞 CD31的表达，结果同样证实 LBL-PLA-RAP 支架表面几乎完全内皮化，在定量分析报告中也说明，其较裸金属支架有更好的内皮亲和力，具备早期快速促进内皮的功能。

层层自组装壳聚糖/肝素涂层膜，已广泛应用于医学生物学的多个领域，本课题组在以往研究[16]中，首次将该涂层膜应用于裸金属支架，发现其具备强大的抗血栓及促内皮化效果。本次研究课题组又将该涂层膜应用于雷帕霉素药物洗脱支架，在确保药物洗脱支架良好药物释放的同时，保留涂层膜强大的抗血栓及促内皮化的效果。该研究为临床前研究，目前结果显示该药物支架有良好的临床应用前景。

结论： LBL-PLA-RAP 支架具有良好的药物释放曲线，并在动静脉分流模型、高血栓负荷模型及1周动物实验中证实其仍具有强大的抗血栓及能够在极早期促进支架内皮化。

致谢：这个项目是由上海市医学重点专科建设项目、上海市普陀区自主创新重大项目，上海市教委项目资助完成。

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Effect of Chitosan/Heparin Rapamycin Drug Eluting Stent on Accelerating the Early Phase Re-Endothelialization and Anti-Thrombus Properties in Porcine Coronary Artery

GAO Jun-qing, JIN Hui-gen, YAN Peng-yong, ZHANG Wen-quan, WU Qian-fu, LIU Zong-jun.

Department of Cardiology, Central Hospital of Shanghai Putuo District, Shanghai (200062), China Corresponding Author: LIU Zong-jun, Email: kevingjq@163.com

Objective: To clarify the effect of chitosan/heparin rapamycin drug eluting stent on accelerating the in-stent early phase re-endothelialization and anti-thrombus properties in porcine coronary artery.Methods: A total of 9 small pigs were divided into 3 models, Arterio-venous shunt model, High thrombosis load model, and coronary artery balloon injury model. n=3 in each model. Each animal was implanted in 3 stents as chitosan/heparin rapamycin drug eluting stent, chitosan/heparin coating stent, and bare metal stent. The anti-thrombus effect of chitosan/ heparin rapamycin drug eluting stent was examined with Arterio-venous shunt and High thrombosis load models, the early phase re-endothelialization effect of chitosan/heparin rapamycin drug eluting stent was evaluated with 1 week-coronary artery balloon injury model.Results: Compared with bare metal stent, chitosan/heparin rapamycin drug eluting stent presented the better antithrombus effect in Arterio-venous shunt and High load thrombosis models, it also showed better re-endothelialization effect in 1 week-coronary artery balloon injury model of animals.Conclusion: Chitosan/heparin rapamycin drug eluting stent has strong in-stent anti-thrombus effect and may improve the early phase re-endothelialization in experimental porcine coronary artery.

Drug eluting stent; Layer-by-layer self-assembly; Chitosan/heparin; Endothelialization; Thrombus

2012-09-10）

（编辑：王宝茹）

*

上海市医学重点专科心内科 (05-II026)；上海市普陀区自主创新项目（B82）

200062 上海市普陀区中心医院 心内科

郜俊清 住院医师 硕士研究生 主要从事冠心病介入治疗的基础研究 Email:kevingjq@sina.com

刘宗军 Email:kevingjq@163.com

R54

A

1000-3614（2013）03-0218-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.03.017

方法：共选取9只小香猪，每种模型（静脉分流模型、高血栓负荷模型、球囊损伤模型）用3只小香猪，每只猪冠脉内分别置入 3 种不同的支架（LBL-PLA-RAP 支架、壳聚糖 /肝素涂层膜支架、裸金属支架）。通过动静脉分流模型与高血栓负荷模型验证 LBL-PLA-RAP 支架的抗血栓作用，通过 1 周猪冠脉球囊损伤模型，观察 LBL-PLARAP支架早期内皮化的作用。

结果：LBL-PLA-RAP 支架在动静脉分流模型与高血栓负荷模型中较裸金属支架有较好的抗血栓作用，且在 1 周的球囊损伤模型中显示较好的内皮化作用。

结论：LBL-PLA-RAP 支架具有强大的抗血栓及能够在极早期促进支架内皮化。