吡唑化合物 pyr3 干预对压力负荷诱导的大鼠左心室肥厚的影响

田小芍 ,陈明 ,刘春霞

吡唑化合物 pyr3 干预对压力负荷诱导的大鼠左心室肥厚的影响

田小芍 ,陈明 ,刘春霞

目 的：探 讨 瞬 时 受 体 电 位 通 道 C 亚 族 3 亚 型（TRPC3） 的 选 择 性 阻 滞 剂 吡 唑 化 合 物 Ethyl-1-(4-(2,3,3-trichloroacrylamide)phenyl)-5-(trifluoromethyl)-1H-pyrazole-4-carboxylate（pyr3）的体内干预对压力负荷大鼠左心室肥厚（LVH）程度的影响。

Ethyl-1-(4-(2,3,3-trichloroacrylamide)phenyl)-5-(trifluoromethyl)-1H-pyrazole-4-carboxylate ；压力负荷；左心室肥厚；瞬时受体电位通道C亚族3亚型；钙调神经磷酸酶Aβ

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:226.)

阻止和逆转左心室肥厚 (LVH)一直是心血管病研究的热点和难点。从 LVH形成机制的研究中寻找有效药理学靶点可能是阻止和逆转 LVH 的重要及可能有效途径。瞬时受体电位通道C亚族3亚型（TRPC3）是细胞膜上非电压依赖的 Ca2+通道。研究显示， TRPC3 在 LVH 形成过程中起重要作用。TRPC3 基因显性失活或体外细胞培养运用 TRPC3 通道阻滞剂均证实能够有效减弱神经内分泌和压力负荷诱导的LVH[1,2]，但目前相关 TRPC3 阻滞剂的体内研究甚少。为此，本研究运用 TRPC3 的选择性阻滞剂 pyr3，探讨其体内干预对压力负荷大鼠LVH程度的影响。

1 材料与方法

材 料： 实 验 的起止 时 间 为 2011-11 至 2012-09。实验动物：8 周龄雄性 SD 大鼠 40 只（重庆医科大学实验动物中心）。主要试剂、仪器：pyr3（美国Sigma 公司 ）；核糖核酸（RNA）提取试剂盒 Trizol、RNA 逆转录试剂盒、脱氧核糖核酸（DNA）标记（宝生物工程大连有限公司）；山羊抗 TRPC3 抗体（英国 Abcam 公司）；兔抗钙调神经磷酸酶 Aβ 抗体（美国 Epitomic 公司 ）；凝胶成像系统和聚合酶链式反应（PCR）仪（美国 BIO-RAD 公司）。

方法：建立模型及实验分组 40 只 8 周龄 SD 大鼠，编号并随机抽出 27 只行腹主动脉缩窄术[3]，术后第 6天，存活的 18 只重新编号并随机分为 3 组（n=6）：手术对照组：仅行腹主动脉缩窄术；手术后全程给药组：术后第6天至第6周末给药的；手术后后期给药组：手术后第5周始到第6周末给药的。另13只行假手术[3]，手术后第 6 天，存活的 12 只编号并随机分为两组（n=6）：假手术对照组(只行腹主动脉剥离，但不做缩窄手术 )；假手术后全程给药组：假手术后第 6 天至第6周末给药的。术后第6天，5组30只大鼠中的各给药组按要求开始每天腹腔注射 pyr3（ 0.1 mg/kg）[4]，对照组给予用双蒸水稀释至 2%的二甲亚砜（1 ml/kg）。

左心室质量指数的检测：5 组共 30 只大鼠术后6周末称重后处死，迅速取出心脏，低温下剪取左心室和室间隔并称重，计算左心室质量指数。

左心室心肌细胞横径的测量：采用 HE 染色，高倍镜采集图片，用 IPP 6.0 软件在每张图片中随机选取20个胞浆清晰、胞核完整的心肌细胞，经核处测量其横径，取均值。

左心 室 TRPC3 和钙调神经磷酸酶 Aβ mRNA表达的测定：Trizol提取总核糖核酸（RNA），反转录生成互补脱氧核糖核酸（cDNA）。扩增引物序列： TRPC3（461bp）F:5'-ttcatggttctcttcatcatgg-3'，R: 5'-aagtcttctcctcctgcatttg-3'； 钙 调 神 经 磷 酸 酶Aβ（265bp）F:5'-ttctcagggaggagagtgaaag-3'，R:5'-gtgttcagggaattgaaaccat-3'；磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) F:5'acagcaacagggtggtggac-3'，R:5'tttgagggtgcagcgaactt-3'；β- 肌 动 蛋 白 (β-actin)F:5'-ccacgaaactaccttcaactcc-3'，R:5'-gtgatctccttctgcatcctgt-3'。 扩 增 TRPC3 基 因 的 PCR条件：94℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，61℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共扩增 35 个循环，于 72 ℃再延伸5 min。扩增钙调神经磷酸酶 Aβ、GAPDH 及 β-actin基因的退火温度为 58 ℃、60 ℃和 60 ℃，均扩增 30个循环，余同 TRPC3 基因的扩增。扩增后进行琼脂糖凝胶电泳。Bio-Rad 凝胶成像系统进行光密度分析，测定以上指标信使核糖核酸（mRNA）相对含量。

左心室 TRPC3 蛋白免疫组织化学染色：按文献方法[5]对各组左心室心肌组织进行包埋、切片及TRPC3 蛋白免疫组织化学染色。用 IPP6.0 图像分析软件分析结果。

左心室 TRPC3 和钙调神经磷酸酶 Aβ 蛋白免疫印迹：提取左心室心肌细胞膜蛋白并定量，进行电泳、转膜、封闭、孵育一抗（TRPC3、钙调神经磷酸酶 Aβ 为 1:2000，β-actin 为 1:1000）和二抗。显色后用 Quantity One 采集图像，β-actin 为内参分析光密度，测定各样本目的蛋白相对含量。

统计学处理：所有数据应用 SPSS Statistics V17.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，组间均数比较采用方差分析，各组两两比较用 Bon ferron i法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

各组大鼠左心室质量指数和左心室心肌细胞横径的比较 ：图1、2 为各组大鼠心肌组织横切面 HE 染色。手术对照组左心室质量指数和左心室心肌细胞横径显著高于假手术对照组；手术后全程给药组和手术后后期给药组上述两个指标较手术对照组均降低，差异均有统计学意义（P均＜ 0.05）。假手术后全程给药组与假手术对照组间两个指标差异无统计学意义。表1

表1 各组左心室质量指数和左心室心肌细胞横径的比较

表1 各组左心室质量指数和左心室心肌细胞横径的比较

注：与假手术对照组比*P ＜ 0.05 与手术对照组比∆P ＜ 0.05

组别 左心室质量指数（m g / g）左心室心肌细胞横径( μ m )假手术对照组 1 . 9 1 ± 0 . 5 9 1 4 . 0 3 ± 0 . 1 7手术对照组 3 . 1 0 ± 0 . 2 7* 2 0 . 4 1 ± 0 . 7 9*假手术后全程给药组 1 . 9 2 ± 0 . 0 5 1 4 . 1 5 ± 0 . 2 7手术后后期给药组 2 . 8 3 ± 0 . 2 3∆ 1 8 . 6 3 ± 0 . 6 0∆手术后全程给药组 2 . 4 6 ± 0 . 1 1∆ 1 5 . 9 5 ± 0 . 3 9∆

图1 各组大 鼠心脏横切面 HE 染色 图2 各组大鼠左心室心肌组织横切面 HE 染色 图3 各组大鼠左心室心肌组织 TRPC3 免疫组织化学染色 A：假手术对照组 B：手术对照组 C：假手术后全程给药组 D：手术后后期给药组 E：手术后全程给药组。TRPC3：瞬时受体电位通道 C 亚族 3 亚型 箭头所指为阳性颗粒

TRPC3 的免疫组织化学染色结果：如图3 所示，棕黄色颗粒为 TRPC3 阳性表达。IPP6.0 软件分析光密度示，手术对照组和假手术后全程给药组 TRPC3表达显著高于假手术对照组；手术后全程给药组TRPC3 表达较手术对照组显著减少，上述差异均有统计学意义（P 均 ＜ 0.05）。

TRPC3 和钙调神经磷酸酶 AβmRNA 的表达：如图4、5示，手术对照组和假手术后全程给药组TRPC3 和钙调神经磷酸酶 Aβ的 mRNA 表达均显著高于假手术对照组；手术后全程给药组上述两个指标均显著低于手术对照组；手术后后期给药组钙调神经磷酸酶 AβmRNA 的表达较手术对照组降低，上述比较的差异均有统计学意义（P 均 ＜ 0.05），而手术后后期给药组 TRPC3 的 mRNA 表达较手术对照组未见显著减少（P＞0.05）。

TRPC3 和钙调神经磷酸酶 Aβ 的免疫印迹结果： 如图6、7 所示，手术对照组和假手术后全程给药组左心室 TRPC3 和钙调神经磷酸酶 Aβ 蛋白表达量显著高于假手术对照组；手术后后期给药组和手术后全程给药组与手术对照组相比，钙调神经磷酸酶 Aβ 表达均有显著下降，而 TRPC3 的蛋白表达只有手术后全程给药组显著降低，上述比较差异均有统计学意义（P均＜ 0.05）。

图4 TRPC3 和 CaN Aβ 基因 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳分析 图5 各组 TRPC3 和 CaN Aβ mRNA 表达的相对含量结果的比较 与假手术对照组比较*P＜0.05 与手术对照组比较∆P＜0.05 TRPC3：瞬时受体电位通道 C亚族 3 亚型 GAPDH：磷酸 甘油醛脱氢酶 CaN Aβ：钙调神经磷酸酶 Aβ mRNA：信使核糖核酸 M：分子量 Marker 余注见图1

图6 各组 TRPC3 和 CaN Aβ 蛋白表达的蛋白免疫印迹结果 图7 各组 TRPC3 和 CaN Aβ 蛋白表达相对含量结果的比较 与假手术对照组比较*P ＜ 0.05 与手术对照组比较∆P ＜ 0.05。 余注见图1

3 讨论

pyr3 能有效阻断 TRPC3 相关的钙库操纵性钙离子内流[6]，减少肥厚因子心房钠尿肽、脑钠肽基因表达[7，8]。日本学者首次指出在体应用 pyr3（0.1mg/kg per day）可以减弱小鼠压力负荷诱导的心肌肥厚[4]。但目前，相关动物体内试验研究报道甚少，结果有待明确。

本研究运用腹主动脉缩窄建立大鼠压力负荷模型，模拟 TRPC 通道激活条件。腹主动脉缩窄手术急性期后即给予 pyr3 直到术后 6 周末，不仅显著减弱了大鼠压力负荷刺激下左心室肥厚的程度，同时也使钙调神经磷酸酶 Aβ 和 TRPC3 蛋白和 mRNA的表达明显下调。据我们所知，这是较早在SD大鼠体内给予 TRPC 通道阻滞剂的实验研究，这一结果有重要的理论意义和潜在的临床价值。

术后第5周开始给药至第6周末的大鼠，虽然左心室肥厚程度及钙调神经磷酸酶 Aβ 蛋白和mRNA 表达也有一定程度的下降，但是 TRPC3 的蛋白和mRNA表达无明显变化。这可能是由于一种涉及 TRPC 通道和钙调神经磷酸酶 /活化的 T 细胞核因子信号通路的激活之间的正反馈调节机制。Bush 等[9]提出 TRPC 通过一种正反馈调节机制促使了心脏肥大增生。病理的压力刺激导致了磷脂酶C的激活和胞内 Ca2+库的排空，这可能使 TRPC 通道激活并产生一个足以激活钙调神经磷酸酶/活化的T细胞核因子信号通路的 Ca2+信号。TRPC3 自身基因表达也受钙调神经磷酸酶/活化的T细胞核因子信号通路的调控，他们形成一种正反馈调节使心脏中肥大基因的表达处于一个稳定的状态。也有学者指出 TRPC3 参与调节心肌细胞中的钙库操纵性钙离子内流，阻止其活性能够减弱神经激素刺激导致的心房钠尿肽的表达和心肌细胞体积的增大，而肥厚心肌细胞中 TRPC3的过表达在心肌肥大的过程中能通过钙调神经磷酸酶 /活化的 T 细胞核因子信号通路得以放大[10]。而腹主动脉缩窄术后第5周才开始给药可能是由于此时心肌肥厚已经形成，压力负荷下 TRPC3 的表达已经明显上调，因此药物干预对肥厚的阻止和逆转效果不明显，TRPC3 基因和蛋白表达较手术不给药也无明显降低，这也可能和给予 pyr3 时间过短有关，推测如果更长时间地给予 pyr3，已经肥厚的心肌可能逆转，有待进一步研究。

作为对照，大鼠假手术急性期后同样用 pyr3 进行干预，发现 pyr3 对假手术大鼠左心室心肌细胞大小无影响，而使钙调神经磷酸酶 Aβ 和 TRPC3 的蛋白和 mRNA 表达上调。这可能是由于生理性的TRPC3 活性被阻滞后，心肌细胞内 Ca2+减少，钙调神经磷酸酶活性减弱，从而通过负反馈作用上调TRPC3 和钙调神经磷酸酶基因和蛋白的表达来实现正常生理需要下 TRPC3 对 Ca2+及调神经磷酸酶对肥厚相关通路的调控。有关TRPC3和钙调神经磷酸酶 /活化的 T细胞核因子信号通路间正负反馈机制非常复杂，仍待深入研究和明确。但是本研究初步证实 TRPC3 选择性阻滞剂 pyr3 较长时间体内干预对高血压左心室肥厚的阻止和初步逆转作用，提示pyr3 或其同类药物可能成为日后心血管临床逆转压力负荷导致的 LVH的新药，值得深入研究。

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Effect of Pyrazol Chemical Compound pyr3 on Pressure Overloaded Rats for Their Left Ventricular Hypertrophy

Tian Xiao-shao, CHEN Ming, LIU Chun-xia.

Department of Cardiology, Chongqing Medical University First Affiliated Hospital, Chongqing (400016), China Corresponding Author: CHEN Ming, Email: chenmingcq@126.com

Objective: To study the effect of a pyrazol chemical compound, pyr3, the selective blocker of transient receptor potential canonical 3 (TRPC3) on pressure overloaded rats for their left ventricular hypertrophy (LVH）in vivo.Methods: The pressure overloaded rats model was established by abdominal aortic constriction. 30 male SD rats With weight of 200～240g were randomly divided into 5 groups: ① Sham operation group, ② Operation control group, ③ Sham operation with whole-course medication group, ④ Operation with later medication group and ⑤ Operation with wholecourse medication group. n=6 in each group and all rats were treated for 6 weeks. The left ventricular mass index (LVMI) and left ventricular myocardial transaction diameter (LVMTD) were calculated; the mRNA and protein expressions of TRPC3 and calcineurin Aβ were examined by RT-PCR, Western blot analysis and immunohistochemistry respectively.Results: Compared with Sham operation group, Operation control group presented the increased LVMI, LVMTD, higher mRNA and protein expressions of TRPC3 and calcineurin Aβ. In Sham operation with whole-course medication group, the left ventricular hypertrophy related indexes were no real changes while the mRNA and protein expressions of TRPC3 and calcineurin Aβ were obviously increased, all P＜0.05. Compared with Operation control group, Operation with whole-course medication groupshowed decreased hypertrophy related indexes and decreased mRNA and protein expressions of TRPC3 and calcineurin Aβ,all P＜0.05. In Operation with later medication group, the hypertrophy related indexes and mRNA and protein expressions of TRPC3 and calcineurin Aβ were decreased, all P＜0.05, while TRPC3 mRNA and protein expression was similar.Conclusion: pyr3 treatment may prevent pressure overloaded rats for their LVH at certain point, and decrease the upregulation of TRPC3 and calcineurin Aβ .

pyr3; Pressure overloaded; Left ventricular hypertrophy; Transient receptor potential canonical 3; Calcineurin Aβ

2012-12-18）

（助理编辑：曹洪红）

400016 重庆市，重庆医科大学附属第一医院 心内科

田小芍 硕士研究生 主要从事高血压的发病机制研究及防治 Email：lmtpershao@163.com 通讯作者：陈明 Email：chenmingcq@126.com

R541

A

1000-3614（2013）03-0226-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.03.019

方法：采用腹主动脉缩窄手术建立左心压力负荷模型。30 只 200～240g 雄性 SD 大鼠随机分为五组 (n=6)：假手术对照组、手术对照组、假手术后全程给药组、手术后后期给药组，手术后全程给药组。6周后，计算各组大鼠左心室质量指数、左心室心肌细胞横径，逆转录多聚酶连反应（RT-PCR）、免疫组织化学和蛋白免疫印迹检测 TRPC3 和钙调神经磷酸酶 Aβ 信使核糖核酸（mRNA）和蛋白的表达水平。

结果：与假手术对照组相比，手术对照组左心室肥厚相关指标 (左心室质量指数和左心室心肌细胞横径 )及TRPC3、钙调神经磷酸酶Aβ蛋白和mRNA的表达显著升高；假手术后全程给药组左心室肥厚相关指标无显著变化，而 TRPC3 和钙调神经磷酸酶 Aβ 蛋白及 mRNA 的表达量显著升高 ,差异均有统计学意义（P均＜ 0.05）。与手术对照组比较，手术后全程给药组左心室肥厚相关指标、TRPC3及钙调神经磷酸酶 Aβ 蛋白和 mRNA 表达均明显降低（P 均＜ 0.05）；手术后后期给药组左心室肥厚相关指标及钙调神经磷酸酶 Aβ 蛋白和 mRNA 的表达下降，差异均有统计学意义（P 均＜ 0.05），而 TRPC3 的蛋白和 mRNA 表达未见显著降低。

结论：pyr3 体内干预能够一定程度上阻止压力负荷导致的大鼠左心室肥厚，降低压力负荷大鼠左心室 TRPC3 和钙调神经磷酸酶Aβ表达的上调。