参考方法测定血清葡萄糖的测量不确定度评价

谢服役 孙琦 吴巧萍

参考方法测定血清葡萄糖的测量不确定度评价

谢服役 孙琦 吴巧萍

目的 探讨参考实验室对测量不确定度的评定方法和程序。 方法 应用美国疾病与预防控制中心推荐的血清葡萄糖测定参考方法对血清样本进行测定，分析整个过程中各不确定度分量的来源，按A、B两类不确定度的计算方式对各分量分别进行评定，计算合成标准不确定度。最后取95%置信区间，计算出扩展不确定度。 结果 血清葡萄糖的平均浓度为15.20mmol/L，合成标准不确定度为0.14mmol/L，取95%置信区间，包含因子k=2，则扩展不确定度U为0.29mmol/L。 结论 参考实验室的测量不确定度与传统的测量误差相比，更能反映测量的水平，对临床检验工作有一定的指导意义，也为采用标准曲线法定量的，如血清葡萄糖、血清总胆红素和血清尿素等参考方法测量结果的不确定度评价提供一定的科学依据。

参考方法 血清葡萄糖 测量不确定度 标准不确定度和扩展不确定度

【 Abstract】 Objective To explore the method and procedure for evaluation of measurement uncertainty of serum glucose in reference laboratory. Methods The concentration of glucose in serum samples was measured by the reference method which was recommended by the U.S.Centers for Disease Control and Prevention (CDC),and the sources of each uncertainty component in whole procedure of analysis were identified.The evaluation of uncertainty components was processed by using two types of method,then a combined standard uncertainty was calculated;finally,an expanded uncertainty was given according to 95% confidence interval. Results The average concentration of glucose was 15.20 mmol/L,the related combined standard uncertainty was 0.14 mmol/L and the expanded uncertainty(U)was 0.29 mmol/L(the desired level of confidence of approximately 95%, the coverage factor k=2). Conclusion Compared to the traditional measurement errors,the measurement uncertainty in reference laboratory may reflect the measurement ability better,and which would be helpful for evaluation of measurement uncertainty in reference laboratory.

测量不确定度是表征合理的赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数。它是以参数形式定量表示无法修正的那部分误差的范围，是用来表征被测量之值所处区间的一种评定。在不确定度评估过程中，要对整个实验的所有步骤进行讨论，找出不确定度来源，并进行计算，由数据可以清晰得出不确定度分量中起主要作用的因素。通过分析不确定度，把测试分析误差控制在允许限度内，保证测试结果有一定的精密度和准确度，使分析数据在给定的置信水平内，有把握达到所要求的质量。当发现质量控制数据将超出预先确定的判据时，应采取有计划的措施来纠正出现的问题，同时采取措施防止报告错误的结果。

为了提高临床检验数据的可比性，促进临床诊断和治疗的有效性，欧盟通过体外诊断用品导则（Directive 98/79/EC）要求体外诊断用品的量值溯源性：“校准物质/质控物质定值的溯源性必须通过已有的高一级的参考方法/参考物质予以保证”。我国关于体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性（GE/T 21415-2008/ISO 17511:2003）于2008-09开始实施。ISO对溯源性的定义中明确指出比较链中每一步都同时给出该值的不确定度。因此，如何评价参考方法测量结果的不确定度成为一个亟待解决的问题。本文按照美国疾病与预防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention,CDC）推荐的血清葡萄糖（GLU）测定参考方法（己糖激酶法）[1-2]，并结合中华人民共和国行业标准（WS/T 350-2011）[3]，参照GUM 1995、GUM 2003、JJF 1059和CNAS-GL05等标准对测量结果的不确定度进行评价，以期为采用标准曲线法定量的，如血清葡萄糖[1-2]、血清总胆红素[4]和血清尿素[5]等参考方法测量结果的不确定度评价提供一定的科学依据。

1 材料和方法

1.1 样本 新鲜血清。

1.2 试剂与仪器 葡萄糖SRM 917c（美国国家标准局，NBS），其余试剂均购自Sigma公司。按照参考方法配制，实验用水为去离子水。UV-2450紫外可见分光光度计（带半导体温控和磁力搅拌）（Shimadzu,Japan）和比色皿[QS，特定光径（10±0.01）mm]用于吸光度（A）的测定；机械移液器（Eppendorf AG,Germany）用来吸取标准溶液和试剂；SevenMulti型 pH计（Mettler Toledo, Switzerland）用来测定溶液pH值；1524型点温计（Fluke USA）用于测定溶液和室内温度；XS205DU型分析天平（Mettler Toledo,Switzerland）用于称取标准物质和试剂；HH60型数显恒温搅拌循环水浴箱（常州国华，中国）用于控制试剂和样本的温度。

1.3 测定方法 测定原理：在己糖激酶催化下，葡萄糖和ATP发生磷酸化反应,生成葡萄糖-6-磷酸与ADP。葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化下脱氢,生成6-磷酸葡萄糖酸，同时使NAD（P）还原NAD（P）H。在NAD（P）转化成NAD（P）H的同时，伴有340nm处摩尔消光系数的上升，摩尔消光系数变化与葡萄糖含量成正比,通过检测339 nm处摩尔消光系数即可测定血清中葡萄糖含量。本次实验在1d内完成，重复测定样本和试剂空白各2次，将测定结果记录后进行统计学分析。

2 结果

2.1 被测量的数学模型 血清葡萄糖的含量c（mmol/L）按下列公式计算：式中，A为样本的吸光度；b0为校正曲线的截距；k为校正曲线的斜率；fc为标准溶液浓度修正因子。

2.2 不确定度的来源分析 测量不确定度的主要来源有样本的A值、校正曲线拟合、标准溶液浓度（包括标准物质称量、定容、稀释、再定容）和测量重复性。取样体积、水浴时间等因素已在重复性中体现，故不单独考虑这些因素。

2.3 分析和量化不确定度分量 标准和实际样本测定：按参考方法进行重复测定，测量数据见表1。

表1 标准和样本的测量数据

2.3.1 重复性（rep） 由表1可知，实际样本用参考方法进行两次测定，其标准偏差为0.0055，那么重复性导致的标准不确定度为：

2.3.2 A值校准引起的不确定度 已知UV-2450紫外可见分光光度计的校准证书给出的吸光度扩展不确定度U=0.005，k=2，us（A）=0.005/2=0.0025。

2.3.3 标准溶液的不确定度 标准溶液的浓度可由下面公式计算得出：式中，m为称取标准物质的质量（g）；V500ml为母液的体积（500ml）；V100ml为稀释液的体积（100ml）；Vx为移取母液的体积（x=0、5、10、20、30、40ml）

其不确定度来源包括标准物质称量、定容、稀释、再定容等几个因素。现逐个分析和量化各分量的不确定度，最后合成标准溶液的不确定度。

2.3.3.1 标准物质质量 称取标准物质约5.000g。采用减量法称量，包括塑料称量盘和毛重2次称量。不确定度主要由天平校准产生。天平校准有3个不确定度来源：线性、重复性和偏载[6]。 u天平=标准物质由两次称量得到，那么，其不确定度为：

2.3.3.2 标准溶液母液体积（V500ml） V500ml主要受到容量瓶校准和温度效应的影响。

2.3.3.2.1 校准 制造商（AS One）提供20℃、体积为（500±0.15）ml的容量瓶，按三角分布计算标准不确定度为

2.3.3.2.2 温度效应 假设温度变化范围±4℃，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，近似矩阵分布，500ml水溶液产生的标准不确定度为

校准和温度效应相互独立，将这两个分量合成，V500ml的标准不确定度为：

2.3.3.3 移取母液体积（Vx） Vx主要受到移液管校准和温度效应的影响。其引起不确定度的计算过程如表2所示。

表2 移液管的不确定度

移取母液体积为30和40ml时，其不确定度需要进一步合成。通过计算可以得出移取30ml和40ml时，所引起的标准不确定度分别为0.0235 ml和0.0281ml。

2.3.3.4 稀释液体积（V100m）l标准溶液V100ml主要受到容量瓶校准和温度效应的影响。

2.3.3.4.1 容量瓶校准 制造商（AS One）提供20℃、体积为（100±0.08）ml的容量瓶按三角分布计算标准不确定度为：

2.3.3.4.2 温度效应 假设温度变化范围±4℃，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，近似矩阵分布，100ml水溶液产生的标准不确定度为：

校准和温度效应相互独立，将这两个分量合成，V100ml的标准不确定度为：

2.3.3.5 合成标准溶液的不确定度 因各分量之间没有相关性，故标准溶液的合成标准不确定度根据下面公式合成。

标准溶液修正因子的标准不确定度可以用下面公式表示：

由于（x=0，5，10，20，30，40ml）各点的计算结果非常相近，计算u（fc）时一般取中位数。但本文为了计算简便，用代替。≈0.00078

2.3.4 由回归方程求得血清葡萄糖的浓度

2.3.4.1 回归方程 根据表1中标准溶液的浓度对吸光度作图所得到的标准曲线见图1。

图1 标准溶液的校正曲线

设回归方程为：A=b0+kc

用最小二乘法求回归方程：b0=-n=0.06293，相关系数R2=0.9995，欲求c的不确定度，应先求A、k、b0的不确定度，然后再合成。

2.3.4.2 回归方程各项不确定度 将b0和k代入公式，求出Ai残差νi=[Ai-（a+kci）]的实验标准差sc/A:

斜率k

截距b0

k和b0的协方差：

k、b0、u（k）、u（b0）、Σvi2等结果均可在Origin软件中求得。

已知，A=b0+kc，那么各影响量的灵敏系数分别为由校正曲线拟合导致的吸光度值的不确定度可以通过下面公式计算：

式中，c为样本测量结果的均值。

2.3.4.3 吸光度A的标准不确定度 根据下面公式可计算出吸光度A的标准不确定度。

c的标准不确定度为：

2.4 合成标准不确定度的计算 血清葡萄糖的合成标准不确定度如下合成：

2.5 血清葡萄糖含量测定结果的报告 扩展不确定度U=k×uc，数据呈正态分布，具有95%置信度时，k=2，U= 0.29mmlo/L。血清葡萄糖含量测定结果为：（15.20±0.29）mmol/L，k=2。

3 讨论

测量不确定度是衡量检测结果准确性和可靠性的重要参数，它在实验室中正确应用可以衡量实验室科学管理和检测水平。因而对其进行合理的分析和评定是实验室质量体系的重要组成部分，也是医学实验室质量管理的重要内容。我们通过测量血清葡萄糖的实验来探讨医学实验室对参考方法测定血清葡萄糖的测量不确定度的评定方法，并试图发现影响测定血清葡萄糖的主要影响因素。

使用电子表格计算方法[7]计算每个分量对测量结果的不确定度的相对贡献。血清葡萄糖的标准不确定度为0.14mmol/L。使用直方图表示各分量的相对贡献（图2），可以得知，吸光度、标准曲线的斜率和截距是影响血清葡萄糖测量不确定度的主要分量。因此，对标准溶液的配制和测定应严加控制，确保测量结果具有较小的不确定度。

图2 各分量的相对贡献

在对血清葡萄糖测定结果进行不确定评估时，我们引入标准溶液修正因子（fc）。由于20、30、40ml）各点的计算结果非常相近，所占的比重又不是很大，因此，本文为了计算简便，在计算u（fc）时直接用代替（基于正常血清的参考值在标准曲线下方考虑）。

本文试图将Origin 8.0作图软件应用到测量不确定度计算过程中，标准曲线中的k、b0、u（k）、u（b0）、Σvi2等结果均可通过Origin 8.0软件求得，这样大大简化了整个计算过程。

总之，参考方法测定血清葡萄糖的测量不确定度主要来源于标准曲线的斜率、截距和吸光度，因此，对标准溶液的配制和测定应严加控制，确保测量结果具有较小的不确定度。临床实验室的测量不确定度与传统的测量误差相比，更能反映测量的水平。对临床检验工作有一定的指导意义。本文中所描述的评估模式可以为采用标准曲线法定量的，如血清葡萄糖、血清总胆红素和血清尿素等参考方法测量结果的不确定度评价提供一定的科学依据。

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[2]Neese J W,Duncan P,Bayse D,et al.Development and evaluation of a hexokinase/glucose-6-phosphate dehydrogenase procedure for use as a nationalglucose reference method[J].Clin Chem, 1974,20:878.

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[7]Eurochem/CITACguide.Quantifying uncertaintyin analyticalmeasurement.2nd ed,EUROCHEM,2000.

（本文编辑：沈叔洪）

更正

本刊2012年第34卷第24期第2010页作者单位更正为“315400余姚市人民医院泌尿肾病外科”。

本刊编辑部

Application of reference method in evaluation of measurement uncertainty of serum glucose

XIE Fuyi,SUN Qi,WU Qiaoping.Depart-

ment of Laboratory Medicine, Lihuili Hospital,Ningbo 315041,China

Reference method Serum glucose Measurement uncertainty Standard and expanded uncertainties

2012-08-01）

315041 宁波市医疗中心李惠利医院检验科