顶空气相色谱-质谱联用法测定茶多酚类制品中有机溶剂残留量

刘相真，孔俊豪，赵粼，许金伟，杨秀芳*

（1.浙江省茶叶集团茶叶研究所有限公司，浙江杭州 310016；2.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016；3.浙江经贸职业技术学院，浙江杭州 310018）

顶空气相色谱-质谱联用法测定茶多酚类制品中有机溶剂残留量

刘相真1，孔俊豪2，赵粼3，许金伟3，杨秀芳2*

（1.浙江省茶叶集团茶叶研究所有限公司，浙江杭州 310016；2.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016；3.浙江经贸职业技术学院，浙江杭州 310018）

建立茶多酚制品中13种有机溶剂残留的顶空气相色谱质谱测定方法。样品经80℃、15m in静态顶空后，采用气相色谱-质谱联用法进行检测。加标回收试验结果表明，13种有机溶剂平均回收率为69.39%～99.01%，相对标准偏差均小于5%。方法的检出限为0.0004～0.339μg/m L。该方法一次进样可同时分离和测定茶多酚制品中13种有机溶剂，准确灵敏，简单快速，适用于茶多酚制品有机溶剂残留的测定。

顶空，气相色谱质谱法，茶多酚，有机溶剂残留

茶多酚是茶叶中多酚类化合物的总称，占茶叶干物质的12%～25%，是茶叶中最重要的生物活性成分之一，是良好的天然抗氧化剂，具有抗癌、抗衰老、抗辐射、消除人体自由基、降血糖脂、防治心血管病、抑菌抑酶、沉淀金属等功能[1]。目前，茶多酚产品主要用于医药、食品和化工等行业。

茶多酚制备一般包含提取、过滤、浓缩、萃取、纯化、干燥等工艺过程[2]。在整个制备过程中，广泛使用有机溶剂，其残留影响到茶多酚制品在药品、食品、化妆品等领域应用的安全性。从各国药典历版的修订内容来看，需控制残留量的有机溶剂种类越来越多，而且对于残留溶剂的控制种类和残留量的可接受限度也与ICH中的要求达到了统一。因此，有必要对茶多酚制品中有机溶剂残留量进行控制，以保证产品质量安全，从而指导生产工艺的改进[3]。

本试验参考《中国药典》有关残留溶剂测定法[4]，采用静态顶空-气相色谱-质谱联用技术对茶多酚类制品中乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲苯、二甲苯等13种残留溶剂进行分析研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890A/5975C气质联用仪和Agilent MSD ChemStation；顶空进样器（DK-5001A）北京中兴分析仪器研究所及顶空瓶（20mL）；旋涡混合器(ABSON,Minplus)；N,N-二甲基乙酰胺（DMAC, Product of TEDIA）；蒸馏水、氯化钠（分析纯）。

正已烷、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、苯、乙腈、三氯甲烷、甲苯、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯等13种溶剂购于天津市化学试剂研究所(纯度≥99.8%)。

1.2 标准溶液的配制

混合标准储备溶液的配制：分别准确称取正已烷、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、苯、乙腈、三氯甲烷、甲苯、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯各504.9mg、514.0mg、476.4mg、488.6mg、1233.2mg、504.7mg、489.2mg、991.1mg、504.0mg、84.0mg、69.2mg、296.5mg、44.5mg置于已加入少量N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）的50mL容量瓶中，待溶解完全后，用N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）定容至刻度。对应的浓度为10.098mg/mL、10.280mg/ mL、9.530mg/mL、9.772mg/mL、24.664mg/mL、10.094mg/mL、9.784mg/mL、19.822mg/mL、10.080mg/mL、1.680mg/mL、1.384mg/mL、5.930mg/ mL、0.890mg/mL。

混合标准使用液（1∶20000）的配制：将混合标准储备溶液，经用水进行逐级稀释至20000倍。

吸取混合标准储备溶液适量，用水进行逐级稀释至所需浓度的混合标准使用液和标准系列。

1.3 测定条件

1.3.1 顶空条件

平衡温度：80℃(见2结果与分析)；平衡时间：15min（见2结果与分析）；传输线温度：120℃；进样针温度：120℃；进样量：1mL。

1.3.2 气相色谱条件

色谱柱：Agilent DB-FFAP石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；进样口温度为180℃，分流比10∶1；柱箱温度为初始温度30℃，保持5min，以每分钟上升5℃，升至80℃，后运行温度为200℃，保持5min；色谱柱初始流速为0.5m L/min，保持4min，以10mL/min升至1mL/min，直至进行结束；载气He（99.999%）。

1.3.3 质谱条件

EI电离能量为70eV，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃，接口温度为280℃，扫描方式为全扫描。

1.4 样品前处理与测定

准确称取茶多酚制品1.00g和NaCl 0.96g，置于顶空瓶中，加入5mL的水，立即盖上盖子，密封，用旋涡混合器振荡1min，按上述条件进行测定，对照混合标准溶液质谱图中各溶剂的保留时间、定量离子和定性离子，确定样品中的残留溶剂，根据定量离子的峰面积计算样品中各个有机溶剂的残留量。

2 结果与分析

2.1 顶空进样条件的选择

2.1.1 平衡温度

样品的平衡温度与被测组分的蒸汽压有直接关系。准确量取5mL混合标准使用液（1∶20000）于顶空瓶中，平衡温度分别为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，平衡时间为15min，自动进样测定，得到各有机溶剂定量离子的峰面积和平衡温度间的关系见图1。

从图1中可知，在相同的平衡时间条件下，随着平衡温度的升高，峰面积随之增大，分析灵敏度也相应提高。但太高的平衡温度会导致顶空瓶气密性变差和水蒸汽进入色谱系统污染毛细管色谱柱及质谱系统，影响方法精密度，所以在满足灵敏度的前提下，尽量选择较低的平衡温度，本实验除甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙腈外，其它溶剂在70℃时峰面积基本达到平衡，而考虑到甲醇在70～80℃之间，峰面积增加较高，因此选择80℃作为本实验的平衡温度。

2.1.2 平衡时间

图1 温度对萃取效率的影响Fig.1 Effect of temperature on extraction efficiency

平衡时间取决于被测组分分子从样品基质到气相的扩散速度，即与分子大小、介质黏度及温度有关。准确量取5mL混合标准使用液（1∶20000）于顶空瓶中，在80℃平衡温度中分别采取5min、10min、15min、20min、25min等不同平衡时间，自动进样测定，得到各有机溶剂的峰面积和平衡时间的关系见图2。因此本实验选择15min为平衡时间。

2.1.3 盐析作用

图2 平衡时间对萃取效率的影响Fig.2 Effect of time on extraction efficiency

在水溶液中加入无机盐（如NaCl）来改变挥发性组分的分配系数。实验证明，盐浓度小于5%时几乎没有作用，故常用高浓度的盐，甚至用饱和浓度。需要指出的是，盐析作用对极性组分的影响远大于对非极性组分的影响[5]。NaCl在平衡温度80℃时的饱和溶解度为38.4g，因此，在已加入5m L混合标准使用液（1∶20000）的顶空瓶中分别加入1.92g、0.96g、0.48g、0.24g、0g NaCl，按测定条件进行检测，得到NaCl对萃取效率的影响见图3。从图3中可知，NaCl对极性组分甲醇、乙腈、丙酮等具有促进作用，而对非极性组分正已烷、乙酸乙酯具有一定的抑制。综合考虑，本实验选择加入0.96g NaCl。

2.1.4 定性定量条件的选择

选择质荷比较大、相对丰度较大的碎片离子作为定量离子，依此原则再选择1到2个碎片离子作为定性离子，以定量离子和定性离子共流出与否以及丰度比来判断样品是否含有目标溶剂，由定量离子的峰面积来定量。13种有机溶剂的质谱参数见表1。

图3 氯化钠对萃取效率的影响Fig.3 Effect of NaCl on extraction efficiency

2.1.5 13种有机溶剂混合标准液总离子流图

图4 13种有机溶剂混合标准液的GC-MS总离子流图Fig.4 GC-MS of a m ixture of 13 organic solvent residues

2.2 标准曲线及线性范围

将混合标准储备溶液，经用水进行逐级稀释至1∶100000、1∶50000、1∶20000、1∶10000、1∶5000，制成系列浓度混合对照溶液；用移液管准确量取5mL各系列浓度混合对照溶液，置20mL顶空瓶中，封瓶，自动进样测定。以定量离子的峰面积为纵坐标，浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表2。

表1 13种有机溶剂的质谱参数Table 1 MS Parameters for 13 organic solvent residues

2.3 检出限及测定限

将混合对照品溶液用水逐步稀释，直到检测峰高为基线噪音的3倍，以3倍信噪比（S/N）所对应的含量即为方法的检出限；以10倍信噪比（S/N）所对应的含量为方法的定量限。各溶剂的检出限见表2。结果表明，13种有机残留溶剂的检出限均远低于浓度限值见表4，满足微量分析的要求。

2.4 精密度和回收率

用移液管准确量取2个浓度混合标准溶液5mL于已放置1.00g茶多酚制品和0.96gNaCl的顶空瓶中，按1.3测定条件进行重复性实验（n= 5），其回收率和相对标准偏差见表3。结果表明，加标样品中13种有机残留溶剂的加标回收率范围为69.39%～100.80%，加标RSD均小于5%，满足微量分析的要求。

表2 标准曲线的回归方程、相关系数、线性范围和检出限Table 2 Regression equation of standard curve,correlation coefficien t,linear range and lim it of detection(LODs)

2.5 样品测定

利用本方法对收集到48个茶多酚样品进行测定，所检样品含有13种有机残留溶剂的一种或几种。所测各样品中有机残留溶剂的最高检出浓度及参考《中国药典》2010版规定的残留溶剂浓度限度值[4]见表4。

3 结论

综上所述，本试验建立的静态顶空气相色谱-质谱联用法测定茶多酚类制品中有机溶剂方法，样品前处理操作简便，方法的线性范围、精密度、准确度满足微量分析的要求，适用于茶多酚类制品正已烷、丙酮、苯、二氯甲烷等13种有机溶剂残留的测定。

表3 精密度和回收率（n=5）Table 3 Recoveries and precisions(n=5)

表4 茶多酚样品中各有机溶剂最高检出浓度及参考限度值Table 4 The highest content for organic solvent residues detected in tea polyphenols specimens and a reference for upper lim its

[1] 杨贤强.茶多酚保健功效研究的新进展[J].茶叶,1992,18(3): 42-45.

[2] 江和源.茶叶功能成分提取制备专题(一)茶叶功能成分的开发利用与提取制备[J].中国茶叶,2009,(1):8-10.

[3] 刘相真,梁慧玲,孔俊豪,等.茶多酚制品中有机溶剂多残留检测方法研究进展[J].中国茶叶加工,2012,(4):23-31.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:中国医药科技出版社,附录ⅧP.

[5] 刘虎威.气相色谱方法及应用[M].北京:化工出版社,2007.

Determ ination of Organic SolventResidues in Tea Polyphenolsby Headspaceand Gas Chromatography-massSpectrometry

LIU Xiang-zhen1,KONG Jun-hao2,ZHAO Lin3,XU Jin-wei3,YANG Xiu-fang2*
(1.Research Institute Co.,LTD of Zhejiang Tea Group,Hangzhou 310016,China; 2.Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China; 3.Zhejiang Economic and Trade Polytechnic,Hangzhou,310016,China)

A headspace and gas chromatography-mass spectrometry(HS-GC/MS)method was established for the determ ination of 13 residual organic solvent in tea polyphenols.The experimental conditions of HS-GC such as static-headspace temperature,headspace time and the analytical conditions of GC and MS were optimized.The tea polyphenols'samples were extracted and cleaned-up by headspace at 80℃for 15min,determined by gas chromatography and mass spectrometry.The 13 poisonous organic solventwere separated efficiently from impurities with high sensitivity and reproducibility.The relative standard deviations(RSDs)were less than 5%,the recoveries were from 69.39%～99.01%,the linear range was 0.0089-4.9823μg/m L with a good linear correlation coefficient(r＞0.991),and the limits of detection were 0.0004～0.339μg/mL bymean of the above developed HS-GC/MSmethod. 13 residual organic solvent in tea polyphenols were detected accurately and simultaneously in a single sample injection.The method is accurate,simple,rapid,and is suitable for the trace analysis ofmulti-mixture of residual organic solvent in tea polyphenols.

Headspace,Gas chromatography-mass spectrometry,Tea polyphenols,Organic solvent residual

TS207.3

A

2095-0306（2013）04-0040-06

2013-09-10

国家质检公益项目（201110210）

刘相真（1980-），男，浙江宁海人，主要从事茶叶理化检验及研究工作。

*通讯作者：teatesting@sina.com