CXCR4和VEGF-C在胃癌淋巴结转移中的作用及相关性

李利义 徐斌 罗越 韩绍伟 金洲祥 郑志强

CXCR4和VEGF-C在胃癌淋巴结转移中的作用及相关性

李利义 徐斌 罗越 韩绍伟 金洲祥 郑志强

目的 探讨CXCR4和VEGF-C在胃癌淋巴结转移中的作用及两者的相关性。 方法 应用免疫组化法及RT-PCR检测CXCR4及VEGF-C在人胃癌组织中的表达水平，并分析其与胃癌淋巴结转移的关系。结果 CXCR4及VEGF-C蛋白在癌旁组织中无阳性表达，在胃癌组织中均呈阳性表达。胃癌组织中CXCR4及VEGF-C蛋白阳性表达率均明显高于癌旁组织（P＜0.05或0.01），且N0组织、N1+N2组织、N3组织中CXCR4及VEGF-C蛋白阳性表达率两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。不同胃癌组织中CXCR4mRNA及VEGF-CmRNA的表达明显不同，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。胃癌组织中CXCR4表达与VEGF-C表达呈显著正相关（r=0.355，P＜0.01）。 结论 胃癌中CXCR4和VEGF-C的表达呈正相关，两者的协同作用与胃癌患者淋巴结转移密切相关，进一步研究两者的作用机制可能对预测淋巴结转移及判断预后有重要临床价值。

CXCR4 血管内皮生长因子-C 胃癌 淋巴转移

胃癌在世界范围内的发病率居恶性肿瘤第二位，占消化道恶性肿瘤的首位。复发和转移是胃癌死亡的最主要原因，其中淋巴结转移是其最常见的转移方式，有研究表明淋巴结转移是胃癌患者预后的独立危险因素[1]。趋化因子CXCR4及其配体CXCLl2所构成的信号传导通路参与调控细胞内肌动蛋白聚合、骨架重排、伪足形成、细胞运动，与肿瘤器官特异性转移密切相关[2]。血管内皮生长因子-C（VEGF-C）因其可通过激活淋巴管内皮细胞上的受体VEGFR-3，从而促进淋巴管内皮细胞增殖分化并诱导淋巴管生成，进而促进胃癌淋巴结转移，是目前临床研究的热点。本研究应用免疫组化及RT-PCR方法检测CXCR4和VEGF-C在人胃癌组织中的表达情况，旨在探讨CXCR4与VEGF-C在胃癌淋巴结转移中的作用及两者的相关性。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2009-12—2010-12在温州医学院附属第二医院外科行手术治疗的胃癌患者76例，其中男52例，女24例，年龄26～79（57.0±1.8）岁。所有患者术前均经病理学证实，均未接受放疗或化疗[3]。按照日本胃癌协会（JGCA）2010年分期标准分期，淋巴结转移情况为：N0者30例，N1者9例，N2者26例，N3者11例。每份标本均于术后10min内取材于肿瘤组织及正常胃黏膜组织（距肿瘤组织边缘＞5cm，作为正常对照），全部标本取材后迅速分成两份，分别置于10%甲醛溶液中固定和-80℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂 兔抗人VEGF-C试剂盒为北京中山生物技术有限公司产品，鼠抗人CXCR4抗体购自美国Sigma公司，免疫组化S-P试剂盒购自德国宝灵曼公司。CXCR4、VEGF-C引物由北京奥科生物技术公司设计。总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购于美国Gibico BRL公司。

1.3 方法

1.3.1 CXCR4和VEGF-C蛋白表达的检测 采用链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶染色法。石蜡切片脱蜡，以微波枸橼酸盐进行抗原修复，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明封片，显微镜下观察，用已知的阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：在组织切片中CXCR4和VEGF-C阳性细胞主要表现为细胞质、细胞膜染为棕黄色。判定标准：采用双盲法计数10个高倍视野，阳性细胞数＜10%为阴性，≥10%为阳性，同时忽略较弱或可疑的染色。

1.3.2 CXCR4 mRNA和VEGF-C mRNA表达的检测 胃癌标本从-80℃冰箱内取出后，迅速置于研钵中，在液氮中研磨为粉末状，然后按试剂盒操作说明提取总RNA。取2μg总RNA，依照试剂盒说明逆转录合成cDNA后行PCR扩增，以3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内对照。扩增引物为：CXCR4前向引物5′-AAGAAACTGAGAAGCATGACC-3′，后向引物5′-GAAACTGGAACACAACCACC-3′，扩增片段大小为293bp。VEGF-C前向引物5′-AATGTGGGGCCAACCGAGAA-3′，后向引物5′-CCAATATGAAGGGACACAACG-3′，扩增片段大小为285bp。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统成像，计算条带的光密度值。结果判定：以同一模板CXCR4或VEGF-C与GAPDH的条带灰度的比值作为CXCR4或VEGF-C的表达指数。

1.4 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用t检验；组间率的比较采用χ2检验；相关性检验采用Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 CXCR4及VEGF-C蛋白在胃癌组织及癌旁组织中的表达情况比较 见表1。

由表1可见，CXCR4及VEGF-C蛋白在癌旁组织中无阳性表达，在胃癌组织中均呈阳性表达（图1-2）。胃癌组织中CXCR4及VEGF-C蛋白阳性表达率均明显高于癌旁组织（P＜0.05或0.01），且N0组织、N1+N2组织、N3组织中CXCR4及VEGF-C蛋白阳性表达率两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。

表1 CXCR4及VEGF-C蛋白在胃癌组织及癌旁组织中的表达情况比较（例）

图1 胃癌组织中CXCR4阳性表达（DAB显色，×400）

图2 胃癌组织中VEGF阳性表达（DAB显色，×400）

2.2CXCR4mRNA及VEGF-CmRNA在胃癌组织中的表达情况比较 见图3、表2。

图3 不同胃癌组织中CXCR4mRNAVEGF-CmRNA的表达情况

由图3及表2可见，不同胃癌组织中CXCR4mRNA及VEGF-CmRNA的表达明显不同，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。

2.3 胃癌组织中CXCR4与VEGF-C表达的相关性 见表3。

由表3可见，胃癌组织中CXCR4表达与VEGF-C表达呈显著正相关（r=0.355，P＜0.01）。

表2 不同胃癌组织中CXCR4mRNA及VEGF-CmRNA的表达指数

表3 胃癌组织中CXCR4与VEGF-C表达的相关性（例）

3 讨论

淋巴结转移是胃癌主要的转移途径，也是胃癌患者预后的独立危险因素。因此，研究淋巴结转移的分子机制，控制淋巴结的转移，已成为临床治疗胃癌的重要环节，也为治疗胃癌的药物研究提供了新的靶点。

趋化因子CXCL12与其特异性受体CXCR4所构成的CXCL12-CXCR4生物学轴在多种肿瘤的播散和器官特异性转移中发挥着重要作用。CXCR4是神经纤毛蛋白-1（Neuropilin-1，NRP-1）的下游分子，是一个编码352个氨基酸且高度保守的G蛋白偶联七次跨膜受体。恶性肿瘤细胞高表达趋化因子受体CXCR4，并可能在CXCL12趋化、牵引下致使肿瘤细胞转移至作为配体产生源的某些器官（如肺、骨、肝、肾、淋巴结等），从而形成器官特异性的转移[4-6]。

Muller等[7]首次报道人乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中高表达趋化因子受体CXCR4，而在乳腺癌最常见的转移部位如淋巴结、肺、肝脏和骨髓则高表达其配体CXCL12，提示趋化因子及其受体的同步高表达在决定乳腺癌器官特异性转移的过程中起着非常关键的作用。Yasumoto等[8]采用免疫组化方法检测胃癌组织中CXCR4的表达，结果显示伴有腹膜转移的胃癌组织中CXCR4的阳性率为67%，显著高于无腹膜转移者的25%。苏一乐等[9]的研究证明，CXCR4在子宫颈癌向盆腔淋巴结组织转移中起重要作用。本研究结果显示，CXCR4在癌旁正常胃组织中无阳性表达，显著低于N0组胃癌组织中的表达率；N1+N2组织中CXCR4阳性表达率明显高于N0组织；且N0及N1+N2组织中CXCR4阳性表达率均明显低于N3组织；同时还发现，随着胃癌淋巴结转移的增加，CXCR4 mRNA表达明显上调。以上结果提示CXCR4的表达可能促进胃癌的淋巴结转移，其可能机制为胃癌组织高表达CXCR4与淋巴结选择性高表达其特异性配体CXCL12，从而促进胃癌的淋巴转移。

VEGF-C是新生血管形成的重要调控因子，可以通过与淋巴管内皮细胞上的VEGF受体结合，增加淋巴管的通透性，促进淋巴细胞的增生，诱导淋巴管的生成[10]。本文结果显示，VEGF-C在癌旁正常胃组织中阳性表达率为9.21%，显著低于N0组织中的阳性表达率（40%）；N1+N2组织中CXCR4阳性表达率明显高于N0组织；且N0及N1+N2组织中CXCR4阳性表达率均明显低于N3组织；另外，随着胃癌淋巴结转移的增加，VEGF-C mRNA表达明显上调。以上结果提示VEGF-C可能与胃癌的发生、发展有关，与有无淋巴结转移密切相关，其表达水平的增高可能促进肿瘤淋巴管的生成及淋巴结的转移。

此外，本研究结果还显示，CXCR4和VEGF-C的表达呈正相关，说明两者在胃癌的发展中存在协同作用。有淋巴转移的46例胃癌标本中有34例表达CXCR4，有36例表达VEGF-C；在33例共同表达CXCR4和VEGF-C的胃癌标本中有28例存在淋巴结转移。这些证据表明CXCR4、VEGF-C与胃癌淋巴结转移密切相关。Tao等[11]发现，VEGF-C和NRP-1结合可以增强肿瘤的存活能力和侵袭活性。因此笔者认为，VEGF-C可能通过某种机制调节CXCR4的产生或表达，形成VEGF-C-NRP-1-CXCR4信号通路，协同促进胃癌淋巴结转移。进一步研究CXCR4和VEGF-C在胃癌淋巴转移中的作用机制，可能为评估胃癌的淋巴结转移情况提供新的生物学指标，亦可能为胃癌淋巴结转移找到新的治疗途径。

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Association of CXCR4 and VEGF-C with lymphatic metastasis in gastric cancer

LI Liyi,XU Bin,LUO Yue,et al.
Department of General Surgery,The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Whenzhou 325027,China

Objective To investigate the association of CXCR4 and VEGF-C with lymphatic metastasis in gastric cancer. Methods The expressions of CXCR4 and VEGF-C proteins and mRNAs in human gastric cancer were detected by immunohistochemistry and RT-PCR,respectively.The relationship between CXCR4 and VEGF-C expressions and lymph node metastasis of gastric cancer was analyzed. Results CXCR4 and VEGF-C proteins were positively expressed in gastric cancer tissue,while they were not detected in pericancerous gastric tissue.The positive rate of CXCR4 and VEGF-C protein expression in gastric cancer tissue was significantly higher than that in pericancerous gastric tissue(P＜0.05 or 0.01).There were significant differences in positive expression rates of CXCR4 and VEGF-C proteins and mRNAs among stage N0,N1+N2and N3gastric cancers(P＜0.05或0.01).The expression level of CXCR4 was positively correlated with that of VEGF-C(r=0.355,P＜0.01). Conclusion The synergy of CXCR4 and VEGF-C was closely related to the lymphatic metastasis of gastric cancer,and further study on the mechanism may has important clinical value in predicting lymph node metastasis and prognosis.

CXCR4 VEGF-C Gastric cancer Lymphatic metastasis

2013-04-01）

（本文编辑：欧阳卿）

温州市科技计划基金资助项目（Y20090061）；温州市瓯海区科技计划项目（20090137）

325027 温州医学院附属第二医院普外科（李利义、罗越、韩绍伟、金洲祥、郑志强）；温州市瓯海区人民医院普外科（徐斌）