人脂肪干细胞复合珊瑚支架在三维培养下成骨活性的初步研究

朱金土 刘波 车菲 尚兴红 高寿松

●论 著

人脂肪干细胞复合珊瑚支架在三维培养下成骨活性的初步研究

朱金土 刘波 车菲 尚兴红 高寿松

目的 探讨人脂肪干细胞（ADSCs）作为种子细胞复合珊瑚支架材料在体外三维培养下的成骨活性。 方法 取行脂肪抽吸术患者的脂肪组织，I型胶原酶消化进行培养，贴壁细胞传代，取第2代细胞进行诱导，培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸和维生素D3。成骨诱导后复合珊瑚继续培养，以未诱导的ADSCs复合物为对照，进行生长曲线、DIO染色后的共聚焦荧光显微镜、碱性磷酸酶（AKP）和骨钙蛋白（OCN）生物化学定量检测。 结果 7～8d后ADSCs在材料上生长进入平台期，诱导ADSCs复合珊瑚7d后生长良好。诱导ADSCs AKP表达随着时间的推移不断增强，而且在检测的各个时间点，诱导ADSCs AKP表达水平均明显高于未诱导ADSCs（均P＜0.05）。诱导ADSCs在珊瑚支架上第7天后检测到OCN表达，并一直增高，且从第7天开始OCN表达均明显高于未诱导ADSCs（均P＜0.05）。 结论 脂肪干细胞复合珊瑚支架在三维培养下能够向成骨细胞表型分化。

脂肪干细胞 珊瑚 碱性磷酸酶 骨钙蛋白

已有实验证实，从人脂肪组织抽吸物中可以获取脂肪干细胞（adipose derived stromal cells，ADSCs），在成骨培养液诱导培养下能够向成骨细胞分化[1]。组织工程核心是形成细胞-支架材料复合物来修复缺损，选用何种支架材料能够使ADSCs在与生物支架材料共培养过程中继续保持细胞的良好生长和成骨活性，仍是需要解决的重要问题。体内实验研究提示，干细胞支架材料复合物有成骨活性[2-4]，但关于人ADSCs在支架材料上三维培养情况下的生长和成骨活性情况研究较少。本研究采用人ADSCs复合珊瑚支架材料进行三维培养，并测定其成骨活性，以期为骨组织工程研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 脂肪抽吸物均来自浙江省中医院整形外科门诊行脂肪抽吸术的患者；珊瑚由广州海洋研究所提供；Ⅰ型胶原酶购自美国Worthington公司；AKP定量检测试剂盒购自Sigma公司，OCN定量检测试剂盒购自Biomedical technologies公司。DMEM培养液购自美国GIBCO公司、10%的FBS购自美国HYCLONE公司；胰蛋白酶、EDTA购自华美生物工程公司；地塞米松、β-磷酸甘油钠和2-磷酸抗坏血酸购自Sigma公司，恒温CO2培养箱购自美国Forma Scientific公司；倒置相差显微镜购自日本Nikon公司；SN 695B智能放免测量仪上海原子核研究所仪器一厂；U-640紫外分光光度计购自美国Beckman Coulter公司；酶联免疫检测仪Dialab公司。超声匀浆机购自Sonics&Materials公司。

1．2 脂肪干细胞培养与传代 无菌条件下将脂肪抽吸物用PBS反复冲洗，尔后移入离心管，加入等体积的0.075%的Ⅰ型胶原酶消化，37°C、1h，加带血清培养液终止消化，1 380r/min离心10min，弃上清液，用100目细胞滤器过滤，再次1 380r/min离心5min，弃上清液，加入含10%FBS DMEM低糖培养液混匀细胞，以2×104/ cm2接种于100mm培养皿中培养。24h后，可见梭型细胞贴壁，每3d更换培养液1次，待细胞融合至约80%时进行传代，传代密度为1×104/cm2。扩增到第2代后，换成骨诱导液（0.01μmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μmol/L抗坏血酸和10μmol/L维生素D3）。

1.3 ADSCs在珊瑚支架上的生长曲线测定 将第2代的诱导和无诱导细胞各以5×106/ml的细胞悬液接种密度接种于3mm×3mm×3mm大小的珊瑚材料上，置入96孔板中，加入各自培养液，次日起每天随机选择4孔诱导和无诱导细胞-材料复合物，以4孔单纯珊瑚作为阴性对照，每孔加入MTT溶液20μl，37℃孵育4h后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μl二甲基亚砜，振荡15min裂解细胞，使沉淀物充分溶解，随后将溶液移至另一96孔板，在酶联免疫检测仪上测定每孔的光密度值（OD490），以时间为横轴，OD490值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.4 DIO标记细胞及激光共聚焦荧光显微镜观察细胞形态 另将第2代诱导ADSCs收集后制成细胞悬液，将DIO用无水乙醇配成2mg/ml的溶液，按1μl/10M的浓度标记细胞；标记前，将所需体积的DIO溶液用10% FBS DMEM稀释250倍，加入ADSCs细胞悬液中，在37℃、5%CO2培养箱中孵育 20min，1 000r/min离心5min，弃上清液，加入PBS冲洗，1 000r/min离心5min，弃上清液，重复1次。标记细胞以5×106/ml的接种密度滴入3mm×3mm×3mm大小的珊瑚，确保材料被细胞悬液浸匀。接种4h后加入成骨诱导培养液，隔天换液1次，细胞材料复合物于接种后第1、3、5、7天行激光共聚焦荧光显微镜观察，DIO的激发波长为484nm，发射波长为501nm。

1.5 ADSCs-珊瑚复合物体外培养后AKP活性定量检测 将第2代的诱导和未诱导细胞各以5×106/ml密度接种于3mm×3mm×3mm大小的珊瑚材料上，置入96孔板中，加入各自培养液，随后次日起在第1、3、7、14、21、28天每天分别各取6块细胞-材料复合物，以6块单纯珊瑚作为阴性对照。操作步骤简述如下：（1）stock substrate 40mg溶解于20ml去离子水中；（2）取36支15ml离心管分别标记实验各组，另取1管作为空白组，各放入0.5ml Alkaline Buffer solution和0.5ml stock substrate solution，37℃水浴10min；（3）每块标本置入15ml离心管中，PBS洗净，将标本碾碎，加入3ml Tris（pH值7.4），超声振荡粉碎（90s、间隔9s、4℃）；（4）取0.1ml混合震荡液加入已标记的离心管中，空白组加入0.1ml去离子水，继续37℃水浴15min；（5）加入10ml 0.05mol/L NaOH终止，405nm紫外分光光度计测光密度值（OD值），以空白对照组进行调零；（6）0.0815OD值=1 Sigma U，1 Sigma U=1μmol ρ-nitrophenol/h。测定的AKP含量单位为nmol ρ-nitrophenol·min-1·块-1。

1.6 ADSCs-珊瑚复合物体外培养后OCN活性定量检测 将第2代的诱导和未诱导细胞各以5×106/ml密度接种于3mm×3mm×3mm大小的珊瑚材料上，置入96孔板中，加入各自培养液，随后次日起在第1、3、7、14、21、28天各取6孔细胞-材料复合物200μl上清液，再取6孔单纯珊瑚200μl上清液作为阴性对照，-20℃冻存留作检测。每个时间点标本收集齐后按以下步骤进行标准浓度曲线和样本中骨钙素浓度测试：（1）各管中均加入100μl125I溶液；（2）实验组管中加入100μlOCN抗血清；（3）振荡混匀30s后37℃水浴2.5h；（4）各管中均加入100μl羊抗兔IgG和100μl PEG，室温放置10min；（5）加入1ml预冷的缓冲液离心15min（4℃、4 200r/min）；（6）吸弃上清液，计数仪计数1min，再根据标准曲线得出骨钙素的相应浓度。测定的OCN含量单位为ng/块。1.7 统计学处理 采用SAS Ver.6.12统计软件，所得数据均以表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 ADSCs-珊瑚复合物体外培养的生长曲线 见图1。

图1 ADSCs在珊瑚上的生长曲线

由图1可见，诱导和未诱导人ADSCs在支架材料上的生长曲线基本相同，其中在接种到珊瑚后的第1、2天，吸光度值变化不明显为细胞的潜伏适应期，从第3天开始细胞迅速增加，第7～8天达最高，第9天则呈下降趋势。细胞在材料上培养的潜伏期约为24～36h，对数增殖期约为3～6d，接种后第7～8天左右进入平台期。诱导和未诱导ADSCs在珊瑚上的生长情况在各个时间点皆无明显差别。

2.2 DIO标记细胞及激光共聚焦荧光显微镜观察情况 接种后第1天，细胞黏附与支架材料的实质部分或在孔的边缘上单层排列，细胞呈均匀的绿色荧光（图2a）；第3天进入对数生长期后，细胞数量明显增多（图2b），至第5天时细胞呈多层排列（图2c）；第7天细胞覆盖了大部分材料表面充分伸展，融合成片，荧光强度未见减弱，细胞和其分泌的细胞外基质充填于珊瑚的孔隙中，占据着大部分空间（图2d）。

2.3 ADSCs-珊瑚复合物体外培养后AKP活性定量检测结果 见表1。

图2 激光共聚焦荧光显微镜下所见（a：第1天；b：第3天；c：第5天；d：第7天）

表1 ADSCs-珊瑚复合物体外培养后AKP活性定量检测结果（nmol ρ-nitrophenol·min-1·块-1）

由表1可见，诱导ADSCs AKP表达随着时间的推移不断增强，而且在检测的各个时间点，诱导ADSCs AKP表达水平均明显高于未诱导ADSCs（均P＜0.05）。

2.4 ADSCs-珊瑚复合物体外培养后OCN活性定量检测结果 见表2。

表2 ADSCs-珊瑚复合物体外培养后OCN活性定量检测结果（ng/块）

由表2可见，诱导ADSCs在珊瑚支架上第7天后检测到OCN表达，并一直增高，且从第7天开始OCN表达均明显高于未诱导ADSCs（均P＜0.05）。

3 讨论

脂肪干细胞是近年的研究热点之一，体外实验已表明，在平面培养状态下，人脂肪干细胞能够向成骨细胞分化[1]。但关于人脂肪干细胞复合材料三维培养状态下的成骨状况却鲜有报道。珊瑚作为一种天然材料有着许多人工材料无可比拟的优点，天然珊瑚的孔径和孔隙率分别为（150±50）μm和（57.60±1.50）%，孔与孔之间都有小孔天然连通形成网络样空间结构，类似于正常骨[5]。珊瑚具有良好的力学强度，且孔隙率高于30%，是组织工程化骨的良好生物材料[6-7]。

本研究结果显示，成骨诱导的ADSCs在第3天进入对数生长期，细胞数量迅速增加，第7～8天进入平台期。生长曲线测定表明，ADSCs在天然珊瑚支架上增殖状况良好。为了进一步观察三维培养下的细胞形态及细胞外基质的分泌情况，本实验通过DIO（DIO是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现绿色荧光[8]）标记细胞，然后借助激光共聚焦荧光显微镜进行观察，发现成骨诱导的ADSCs第7天细胞覆盖了大部分材料表面充分伸展，融合成片，细胞形态良好，与其分泌的细胞外基质充填于珊瑚的孔隙中，占据着大部分空间。

AKP是成骨细胞分化的标志，在体内钙化过程中起关键作用，其活性高低可反映成骨细胞的成熟状况，AKP活性越高，表明细胞向成骨细胞分化的程度越高[9]。本文结果显示，诱导组不同时点AKP活性随诱导时间延长而增强，与对照组比较差异有统计学意义。OCN是骨组织中成骨细胞合成的特异性蛋白，是骨代谢细胞分化成熟，处于功能状态的标志，可作为成骨细胞活动的标志性产物[10-11]。本文结果显示，在7d后的各个时间段诱导的ADSCs-材料组OCN表达均显著高于对照组，说明在材料上三维生长的情况下，虽然诱导和未诱导ADSCs都有成骨分化，但诱导ADSCs的成骨活性明显更强。由此可见，珊瑚材料作为三维支架是适合人ADSCs向成骨诱导分化的，天然珊瑚是ADSCs生长和成骨转化的良好生物支架材料，有可能成为ADSCs的生物支架用于组织工程化骨的构建。

[1] Zuk P A,Zhu M,Ashjian P,et al.Human adipose tissue is a source ofmultipotent stem cells[J].MolBio Cell,2002,13(12):4279-4295.

[2] 刘波,崔磊,刘广鹏,等.自体脂肪干细胞复合珊瑚修复犬颅骨标准缺损的初步研究[J].中华整形外科杂志,2009,25(3):204-208.

[3] Cowan C M,Shi Y Y,Aalami O O,et al.Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects[J].Nat Biotechnol,2004,22(5):560-567.

[4] Ito Y,Tanaka N,Fujimoto Y,et al.Bone formation using novel interconnected porous calcium hydroxyapatite ceramic hybridized with cultured marrow stromalstem cells derived from Green rat[J]. J Biomed Mater Res,2004,69(3):454-461.

[5]袁捷,刘广鹏,祝联,等.骨髓基质干细胞体外复合珊瑚材料的生长和成骨活性[J].组织工程与重建外科杂志,2006,2(5):251-255.

[6] Xiao C,Zhou H,Ge S,et al.Repair of orbital wall defects using biocoral scaffolds combined with bone marrow stem cells enhanced by human bone morphogenetic protein-2 in a canine model[J].Int J MolMed,2010,26(4):517-525.

[7]Lane J M,Bostrom MP.Bone grafting and newcomposite biosynthetic graft materials[J].Instr Course Lect,1998,47:525-534.

[8]Timmers M,Vermijlen D,Vekemans K,et al.Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy[J].J Microsc,2002,208(1):65-74.

[9] TaziN,Zhang Z,Messaddeq Y,et al.Hydroxyapatite bioactivated bacterial cellulose promotes osteoblast growth and the formation ofbone nodules[J].AMB Express,2012,2(1):61-65.

[10]Wang W,Olson D,Liang G,et al.Collagen XXIV(Col24α1)Promotes Osteoblastic Differentiation and Mineralization through TGF-β/Smads Signaling Pathway[J].Int J Biol Sci,2012,8(10): 1310-1322.

[11]TaddeiS R,Moura AP,Andrade IJr,et al.Experimentalmodelof tooth movement in mice:A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains[J].J Biomech,2012,45(16):2729-2735.

Osteogenesis ability of human adipose stem cells on coral scaffolds in vitro

ZHU Jintu，LIU Bo，CHE Fei，et al.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Zhejiang Traditional Chinese Medicine Hospital，Hangzhou 310006,China

Objective To investigate the osteogenic ability of human adipose stem cells(ADSCs)in coral scaffolds in vitros. Methods ADSCs were isolated from liposuction aspirates,then digested by type I collagenase;the passage 2 cells were cultured in conditioned medium containing dexamethasone,β-glycerophosphate,ascorbate-2-phosphate and VD3.The induced cells were co-cultured with coral scaffold and non-induced ADSCs-coral construct served as control.The constructs were examined with growth curve,confocal microscopy and quantitative histochemistry. Results The growth curve demonstrated that the proliferation of ADSCs on coral scaffolds reached plateau after 7-8 d of co-culture.Confocal microscopy and quantitative histochemistry showed that ADSCs grew well and began to express osteocalcin on the coral scaffolds after 7d of culture. Quantitative histochemistry demonstrated that the expressions of alkaline phosphatase(AKP)and osteocalcin(OCN)in induced ADSCs-scaffold were higher than those in non-induced ADSCs-scaffold(P＜0.05). Conclusion The coral scaffold is a good biomaterial for ADSCs growth and being induced to osteoblasts.

Adipose derived stromal cells CoralAlkaline phosphatase Osteocalcin

2012-12-28）

（本文编辑：欧阳卿）

浙江省自然科学基金资助项目（Y2080180）

310006 杭州，浙江省中医院整形外科