血浆循环DNA浓度在原发性干燥综合征和系统性红斑狼疮诊治中的意义

叶俏 沈洁 李红胜

血浆循环DNA浓度在原发性干燥综合征和系统性红斑狼疮诊治中的意义

叶俏 沈洁 李红胜

目的 比较原发干燥综合征（pSS）、系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血浆中循环DNA（cDNA）浓度的差异性，探讨cDNA浓度在pSS、SLE诊治中的意义。 方法 选用人类基因组管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）设计引物，测定pSS、SLE及健康对照组中血浆cDNA浓度，同时测定血沉（ESR）、C-反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）并评定不同疾病的活动指数和损害指数，分析血浆cDNA浓度与疾病活动性、相关参数的关系。结果 pSS组cDNA浓度[（368.24±196.68）ng/ml]明显高于SLE组[（244.51±164.10）ng/ml]及健康对照组[（24.56±16.76）ng/ml]，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；pSS组中的cDNA浓度值与干燥综合征活动指数（SSDAI）呈正相关（P＜0.05），与干燥综合征损害指数（SSDDI）无相关性（P＞0.05）；SLE组中cDNA浓度值与SLE活动指数（SLEDAI）无相关性（P＞0.05）。 结论 cDNA浓度可作为pSS与SLE鉴别指标之一，pSS患者cDNA浓度与SSDAI呈正相关，可作为pSS疾病活动性观察指标之一。

血浆循环DNA 原发性干燥综合征 系统性红斑狼疮 干燥综合征活动指数 干燥综合征损害指数 系统性红斑狼疮活动指数

1 对象和方法

1.1 对象 选择2010-08—2013-02本院住院与门诊pSS患者36例，男3例，女33例，年龄24～77岁，平均（52.3±13.8）岁。初发14例，非初发22例，入组病程1个月～30年，平均（45.9±66.2）个月；均符合2002年干燥综合征国际分类标准[1]。选择本院住院与门诊的SLE患者（排除继发干燥综合征患者）共29例，均为女性，年龄18～63岁，平均（38.3±12.2）岁。初发10例，非初发19例；入组病程2d～30年，平均（50.1±88.3）个月。诊断符合美国风湿病学会（ACR）1982年推荐的SLE分类标准[2]。收集本院职工健康体检者30例作为健康对照组，男2例，女28例，年龄29～66岁，平均（46.6±10.2）岁。排除感染、肝炎、结核、创伤、应激、严重的心血管及脑血管疾病急性期等可致cDNA升高患者。3组性别及病程的差异无统计学意义（P＞0.05），而年龄的差异有统计学意义（P＜0.05），但是cDNA值是个独立的因素，不受性别和年龄影响[3]，因此不影响cDNA的结果。

1.2 主要试剂和仪器 微量样品DNA提取试剂盒、DH5α感受态细菌（天根生化科技有限公司），TaKaRa SYBR Premix Ex Taq、TaKaRa Ex Taq、TaKaRa DNA 6Loading Buffer、aKaRa DL2000 DNA Marker（大连宝生物工程有限公司），pGEM-T Vector Systems I(美国Promega公司)，酵母提取物、胰蛋白胨（上海生工生物工程有限公司），GenClean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司），LightCycler 480（Roche Diagnostics）实时定量仪（瑞士罗氏公司），Immage 800测定蛋白分析仪（美国Beckman Coulter公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 取静脉血5ml置于EDTA抗凝管中，以800g离心力离心10min后将上清血浆吸置清洁离心管，再离心10min，取上清液，避免搅动沉淀层。上清液继续离心10min，使血浆中的不容物沉淀。完全去除血细胞成分置干燥洁净冻存管中，-80°C低温冰箱保存备检，统一检测。

1.3.2 DNA的提取 采用血液基因组小量提取试剂盒（BloodGen Mini Kit）抽提DNA。抽提方法依据试剂盒使用说明：取200μl血浆样品至离心柱中，加入Protease，采用50μl Buffer溶解提取的DNA，-20℃保存。

1.3.3 血浆DNA的扩增 采用LightCycler 480（Roche Diagnostics）进行实时定量检测，试剂使用SYBR Green PCR kit（TaKaRa SYBR Premix Ex Taq），实时定量PCR扩增定量管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），GAPDH引物序列：Primer Forward：5＇-CTGGGCTACACTGAGCACC-3＇，Primer Reverse：5＇-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3＇，PCR产物长度186dp。引物由上海生工生物工程有限公司合成，扩增反应体系为10μl，扩增反应采用三步法PCR扩增标准程序：50个循环数，预变性：95℃30s，PCR反应：（50个循环）95℃5s，55℃30s，72℃30s。

1.3.4 标准品的制备 采用正常人血浆提取质粒，并检测质粒吸光度（OD）值，通过所得OD值计算核酸质量，采用跨内含子的基因GADPH的引物扩增样品，测得样品血清中核酸的具体含量，并对质粒进行10倍的梯度稀释，得到浓度相差10倍的一系列标准品备用，扩增具有不同底物浓度的标准品（0.035、0.35、3.5、35、200ng），利用各标准品扩增所得Ct值与相应标准品浓度的对数值进行线性拟合，得到样品模板量计算公式为：X=（Y-28.69235）/-3.62966（Y：Ct值，X：模板量），根据公式计算标本cDNA含量。

1.4 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，相关分析定量资料采用Pearson相关分析，等级资料采用Spearman相关分析。

2 结果

2.1 3组cDNA浓度值的比较 见表1。

表1 3组cDNA浓度值比较

由表1可见，3组血浆cDNA浓度值中pSS组最高，SLE组次之，且pSS组与SLE组cDNA浓度值明显高于健康对照组，3组间cDNA浓度值的差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.2 pSS组、SLE组cDNA浓度值与各指标间的相关性分析 见表2、3。

表2 pSS组cDNA浓度值与各指标间的相关性分析

表3 SLE组cDNA浓度值与各指标间的相关性分析

由表2、3可见，pSS组中cDNA浓度值与干燥综合征活动指数（SSDAI）、IgG呈正相关（P＜0.05），与其他指标均无相关性（均P＞0.05）；SLE组中cDNA浓度值与其他指标均无相关性（均P＞0.05）。

3 讨论

cDNA又称为游离DNA（cell-free DNA），1948年第1次被证实存在；1986年Tan首次报道在红斑狼疮患者中cDNA升高，cDNA才在免疫性疾病中得到关注。正常人血浆、血清中存在微量游离DNA，扩增这些DNA发现，来源于各条染色体的片段数与该染色体的大小有关[4]，片段中内含子、外显子、插入序列的比例与全基因组构成比相似，因此cDNA与疾病密切相关。cDNA作为恶性肿瘤的监测生物学标记，在炎症、疼痛、慢性疾病等情况下也会升高[5-6]。本试验利用荧光定量PCR的方法检测样品血清中的游离核酸含量，并以GADPH作为游离核酸定量的指标测定cDNA，分析cDNA在pSS及SLE中的价值。

本研究中测定了pSS、SLE患者外周血浆的cDNA，结果发现pSS组患者cDNA浓度值为（368.24±196.68）ng/ml，SLE患者cDNA浓度值为（244.51±164.10）ng/ml，而正常者cDNA浓度值为（24.56±16.76）ng/ml，3组间的差异有统计学意义（P＜0.05），与Bartoloni等[7]报道相一致。在pSS、SLE患者中，cDNA的升高可能与细胞的凋亡坏死、活性细胞的产生、DNA片段的产生及清除不平衡等有关。作为免疫调节活性的cDNA通过暴露在细胞膜上和（或）细胞内cDNA相互作用，识别靶细胞表面结合的寡脱氧核糖核苷酸（ODN）类似物起作用[8]。健康者的cDNA是由细胞凋亡生成的DNA的小片段，而癌症患者的cDNA源于细胞坏死、自噬或有丝分裂[9]。在pSS、SLE患者cDNA产生是否有类似于肿瘤产生机制，目前尚不明确。本研究中pSS组患者的cDNA最高,细胞的凋亡也许是形成cDNA升高的主要因素[7]，是否有其他途径参与cDNA合成，有待进一步研究。

在自身免疫性疾病活动中，T细胞和（或）B细胞自主的克隆，B细胞的自动反应、T细胞的克隆和巨噬细胞产生自身免疫性抗体、大量可溶性炎性分子及细胞表面的蛋白质，这些物质能引起病理生理的紊乱，高选择性的DNA也是这样产生，类似于在肿瘤中产生的机制。活化淋巴细胞参与免疫性疾病过程，目前已证实活化的淋巴细胞在有丝分裂下能综合和分泌核酸和染色体外DNA，这也是cDNA升高原因。在SLE患者中，cDNA高于对照组，在氯喹治疗后显著下降[10]，也证实cDNA在自身免疫性疾病中成为生物学标记可能。

本研究结果表明，pSS组中患者cDNA浓度值与SSDAI、IgG成正相关性（P＜0.05），但是cDNA浓度值与干燥综合征损害指数（SSDDI）无相关性（P＞0.05），因此cDNA值可作为观察pSS疾病活动性的生物学指标之一。在SLE组中，cDNA与SLE活动指数（SLEDAI）并无相关性（P＞0.05），这能否说明cDNA在两疾病中是有差别的，能否作为作为pSS与SLE鉴别观察指标，有待于扩大样本量及延长观察时间证实。

综上所述，cDNA不论在SLE、pSS中均升高，不同疾病之间也有差异，cDNA可能会是pSS与SLE鉴别的一种新的生物学标记，也可能是pSS活动性观测指标。

[1]Vitali C,Bombardieri S,Jonsson R,et al.Classification criteria for Sjo gren's syndrome:a revised version of the European criteria proposed by the American-European Consensus Group[J].Ann Rheum Dis,2002,61(6):554-558.

[2]Tan E M,Cohen A S,Fries J F,et al.The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum,1982,25(11):1271-1277.

[3]Arnalich F,Codoceo R,López-Collazo E,et al.Circulating cell-free mitochondrial DNA:a better early prognostic marker in patients with out-of-hospital cardiac arrest[J].Resuscitation,2012,83(7): 162-163.

[4]Suzuki N,Kamataki A,Yamaki J,et al.Characterization of circulating DNA in healthy human plasma[J].Clin Chim Acta,2008,387(1-2): 55-58．

[5]ArnalichF,CodoceoR,López-Collazo E,et al.Circulating cell-free mitochondrial DNA:a better early prognostic marker in patients with out-of-hospital cardiac arrest[J].Resuscitation,2012,83(7): 162-163.

[6]Breitbach S,Tug S,Simon P.Circulating cell-free DNA:an upcoming molecular marker in exercise physiology[J].Sports Med, 2012,42(7):565-586.

[7]Bartoloni E,Ludovini V,Alunnol A,et al.Increased levels of circulating DNA in patients with systemic autoimmune diseases:A possible marker of disease activity in Sjo gren's syndrome[J].Lupus,2011,20(9):928-935.

[8]Cherepanova A V,Bushuev A V,Duzhak T G,et al.Ku protein as the main cellular target of cell-surface-bound circulating DNA[J]. Expert Opin Biol Ther,2012,12(1):35-41.

[9]Delgado P O,Alves B C,Gehrke Fde S,et al.Characterization of cell-free circulating DNA in plasma in patients with prostate cancer[J].Tumour Biol,2013,34(2):983-986.

[10]Cepika A M,Soldo Juresa D,Morovic Vergles J,et al.Decrease in circulating DNA,IL-10 and BAFF levels in newly-diagnosed SLE patients after corticosteroid and chloroquine treatment[J]. Cell Immunol,2012,276(1-2):196-203.

Plasma circulating DNA levels in patients with primary Sjo gren's syndrome and systemic lupus erythematosus

Objective To investigate the plasma circulating DNA（cDNA）levels in patients with primary Sjgren's syndrome(pSS)and systemic lupus erythematosus(SLE),and its clinical significance.Methods The primer was designed by human genome housekeeper gene GAPDH.Levels of cDNA,erythrocyte sedimentation rate(ESR),C-reaction protein(CRP)and immunoglobulin(IgA,IgG and IgM)in each group were detected.Meanwhile,the activity index and damage index of different diseases were assessed,and the relations between cDNA and disease activity were analyzed.Results The levels of plasma cDNA in pSS group(368.24±196.68ng/ml)were apparently higher than those in SLE group(244.51±164.10ng/ml)and normal control group(24.56±16.76ng/ml),and the differences were significant statistically(both P＜0.05).The levels of cDNA in each disease group were significantly higher than those in normal control group (both P＜0.05).In pSS group:cDNA level was positively correlation with Sjgren's syndrome disease activity index(SSDAI)(P＜0.05).But there was no correlation between cDNA concentration and Sjo gren's syndrome disease damage index(SSDDI)(P＞0.05).In SLE group:cDNA level did not correlate with SLE disease activity index(SLEDAI)(P＞0.05).Conclusion The cDNA level may be a valuable indicator for distinguishing pSS from SLE.And it can be taken as one of the disease activity indices of pSS.

Plasma circulating DNA Primary Sjo gren's Syndrome Systemic lupus erythematosus Sjgren's syndrome disease activity index Sjgren's syndrome disease damage index SLE disease activity index

2013-07-16）

（本文编辑：严玮雯）

（本文由浙江省医学会风湿病学分会推荐）

嘉兴市科技计划项目（2013AY21043-11）

314000 嘉兴市第二医院风湿免疫科（叶俏、沈洁），检验科（李红胜）

叶俏，E-mail：lyjxsh_yq32@163.com