类风湿关节炎患者血清骨形态发生蛋白6和铁调素与贫血的关系

2013-04-17邬秀娣张振陈勇谢斌华干敏芝黄娴倩刘磊

浙江医学 2013年18期

邬秀娣张振陈勇谢斌华干敏芝黄娴倩刘磊

邬秀娣张振陈勇谢斌华干敏芝黄娴倩刘磊

目的探讨类风湿关节炎（RA）患者骨形态发生蛋白6(BMP-6)和铁调素(Hepc)与贫血的关系。方法采用酶联免疫吸附法测定99例RA患者、19例系统性红斑狼疮（SLE）患者、40例健康志愿者的血清BMP-6、Hepc水平,同时检测RA患者的红细胞计数（RBC）、血红蛋白水平（HGB）、白细胞介素6(IL-6)、血清铁（SI）、血清可溶性转铁蛋白受体（sTfR）、铁蛋白（SF），分析比较RA组与SLE组和健康对照组、RA患者贫血组与非贫血组、慢性病性贫血（ACD）与慢性病伴缺铁性贫血（IDA+ACD）组间及不同疾病活动度组间BMP-6、Hepc和其他贫血相关指标,以及RA患者血清BMP-6和Hepc水平与其他因素间的相关性。结果 RA患者贫血发生率为59.6%，其中ACD占52.5%,IDA+ACD占47.5%。血清BMP-6和Hepc水平在RA患者中明显升高，与SLE组、健康对照组的差异均有统计学意义（均P＜0.05）。RA贫血组的IL-6水平及类风湿关节炎疾病活动性评分（DAS28）较非贫血组均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），而两者SI、SF、BMP-6和Hepc水平的差异均无统计学意义（均P＞0.05）；RA伴ACD患者的血清SF、Hepc、BMP-6水平及DAS28评分均明显高于RA伴IDA+ACD组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。DAS28＞5.1的RA疾病高度活动组血清BMP-6及Hepc较DAS28评分≤5.1的疾病非高度活动组明显升高，而HGB水平明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。RA患者的血清BMP-6与Hepc水平呈正相关（P＜0.01），且两者均与IL-6、DAS28呈正相关（P＜0.05），BMP-6还与SI呈正相关（P＜0.05）。结论 RA患者贫血类型以ACD为主，其血清BMP-6和Hepc水平均明显升高，在伴ACD或疾病高度活动的RA患者中升高尤其明显，且互相关系密切，说明BMP-6和Hepc水平异常正是诱导RA患者发生ACD的主要因素之一，两者可能可以作为RA患者ACD治疗的靶点，其在RA中的作用机制值得进一步研究探索。

类风湿关节炎铁调素骨形态发生蛋白6 贫血

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的全身性慢性炎症性疾病,贫血为RA患者中最常见的关节外症状之一，发生率在30%～60%。RA患者合并严重的贫血时可加重全身症状及关节功能障碍,从而影响预后。目前，已有许多研究都提示RA贫血的发病机制可能不同于普通贫血[1]。铁调素（hepcidin，Hepc）是2000年发现的铁代谢调节因子，与贫血关系十分密切[2]；骨形态发生蛋白-6（bone morphogenetic protein-6，BMP-6）是转化生长因子β（TGF-β）超家族的一员[3]，有研究提示其通过对Hepc的调节作用参与了铁代谢[4]。笔者为进一步探讨BMP-6及Hepc在RA贫血发病机制中的作用，开展横断面探索性研究，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料选择2011-10—2013-03在我科住院、有完整资料的患者，其中RA患者（RA组）99例，男18例，女81例，年龄32～71岁，平均（55.82±14.52）岁；均符合2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿联盟（ACR/ EULAR）修订的RA分类标准[5]。系统性红斑狼疮患者（SLE组）19例，其中男2例，女17例，年龄28～65岁，平均（45.63±13.38）岁；诊断均符合1997年ACR修订的分类标准[6]。选择同期在我院体检中心体检的健康志愿者40例作为健康对照组，男8例，女32例，年龄30～65岁，平均（53.45±11.73）岁。排除标准：合并除RA和SLE及其继发疾病外的其他慢性系统疾病及急、慢性感染；恶性肿瘤；严重肝、肾功能异常（血清总胆红素、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶＞2倍参考值上限，血清肌酐、尿素氮＞1.5倍参考值上限）；半年内有明确出血史、手术史或分娩史；妊娠3个月内；有补充铁剂治疗或生物制剂治疗史。健康对照组参照个人档案及其他检查结果，排除已患有急、慢性疾病者。本研究得到本院医学伦理委员会批准，所有参与者均知情并同意其血液用于临床研究。3组性别、年龄的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 方法所有标本为空腹12h以上后于次日清晨7: 00～9:00抽取外周静脉血15ml，其中5ml立即用于检测血沉（ESR）、血常规[含红细胞计数（RBC）和血红蛋白含量（HGB）]，另10ml予2 000r/min离心10min后，取血清，检测C反应蛋白（CRP）及血清铁蛋白（SF）。剩余血清置于-80℃冰箱中保存，待统一融解后用于检测血清BMP-6、Hepc、白细胞介素6（IL-6）、血清铁（SI）及血清可溶性转铁蛋白受体（sTfR）5项。ESR检测采用魏氏法，血常规及CRP、SF的检测分别使用Beckman-Coulter公司生产的全自动血球计数仪和Array360特定蛋白分析仪；SI采用购自Blue-Gene公司的试剂盒检测；Hepc、IL-6使用购自Green-Gene公司的试剂盒，BMP-6及sTfR采用购自R&D System公司的试剂盒，该4项检测均采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验，按照说明书步骤操作，并绘制标准曲线。

1.3 监测指标疾病活动性评估采用类风湿关节炎疾病活动性评分（DAS28），由关节肿胀数、压痛数、患者自我综合评分、ESR、CRP构成，DAS28评分≤5.1分认为疾病非高度活动，＞5.1分认为高度活动。将男性HGB＜120g/L、女性HGB＜110g/L者定义为贫血。将贫血患者中sTfR/logSF指数＜1.5者界定为单纯慢性病性贫血（ACD），sTfR/logSF≥1.5为慢性病伴缺铁混合性贫血（IDA+ACD）[7]。

1.4 统计学处理采用SPSS17.0统计软件。计量资料呈非正态分布的以中位数（四分位数范围）表示，两两比较采用Mann-Whitney U检验，两个以上样本比较采用Kruskal-Wallis检验；正态分布的以表示，两独立样本比较采用t检验，两个以上独立样本比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；服从正态分布的双变量采用Pearson相关分析，否则采用Spearman秩相关分析。

2 结果

2.1 一般资料 RA组贫血患者为59例（59.6%），其中ACD 31例（52.5%），IDA+ACD 28例（47.5%）；SLE组贫血7例，占36.8%；对照组贫血3例，占7.5%。

2.2 3组间实验室检测结果的比较见表1。

由表1可见，与健康对照组比较，RA组血清Hepc、BMP-6及SI水平均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与SLE组比较，RA组血清Hepc、BMP-6及SI水平也明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；同时，RA组的HGB水平也低于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），但与SLE组的差异无统计学意义（P＞0.05）；而SLE组、健康对照组RBC、SF的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与健康对照组比较，SLE组SI水平明显升高，HGB水平则降低，差异有统计学意义（P＜0.05），但Hepc、BMP-6、RBC及SF水平的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 3组间实验室检测结果的比较

2.3 RA患者中贫血组和非贫血组间各种贫血相关因子及DAS28指数、IL-6、BMP-6和Hepc水平的比较本研究结果显示，贫血组的IL-6水平及DAS28评分分别为（164.56±126.25）pg/ml、（5.73±1.87）分，均明显高于非贫血组[（112.13±119.56）pg/ml、（4.52±1.68）分]，差异有统计学意义（P＜0.05）；而两组年龄、病程和血清SI、SF、BMP-6及Hepc的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.4 RA患者ACD组与ACD+IDA组实验结果的比较见表2。

表2 RA贫血患者ACD组与ACD+IDA组实验结果的比较

由表2可见，ACD组的血清SF、Hepc、BMP-6水平及DAS28评分均明显高于IDA+ACD组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而病程以及年龄、RBC、HGB、SI和IL-6在两组的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.5 RA患者疾病非高度活动组与高度活动组间结果的比较在RA患者中DAS28评分≤5.1的疾病非高度活动患者共45例，DAS28评分＞5.1的疾病高度活动患者共54例，疾病高度活动组患者的血清SF、Hepc、BMP-6水平分别为（189.99±135.31）μg/L、（14.71±8.16）ng/ml、（0.56±0.30）ng/ml，明显高于疾病非高度活动组[（109.79±97.53）μg/L、（6.04±5.38）ng/ml、（0.27±0.16）ng/ml]；疾病高度活动组HGB为（100.02±18.70）g/L，明显低于疾病非高度活动组[（114.87±14.05）g/L]，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而年龄、RBC、SI及IL-6在两组间的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.6 RA患者血清BMP-6及Hepc与其他贫血相关因素间的相关性分析结果见表3。

由表3可见，RA患者的血清Hepc与BMP-6呈正相关（P＜0.05）；而Hepc与BMP-6均同时与IL-6、DAS28评分呈正相关（P＜0.05）。此外，BMP-6与SI呈正相关（P＜0.05）。但Hepc、BMP-6和年龄、RBC、HGB及SF均无相关性（均P＞0.05）。

表3 RA患者BMP-6和Hepc与其他因素相关性分析结果

3 讨论

RA患者伴发贫血的原因很多，铁摄入不足、药物影响胃肠道引起的失血等原因均可引起IDA，但由于RA是一个慢性炎症性疾病，故普遍认为在RA患者中没有单纯IDA，更多的是ACD或ACD+IDA混合，其体内铁储存往往是正常或偏高的[8]。本研究结果表明，在RA患者中，贫血的发生率高达59.6%，不仅比正常人群高，也比SLE患者的贫血发生率高；同时，RA患者在HGB明显偏低的状态下，其SF水平与对照组无统计学差异，SI水平反而明显升高，均与Wahle等[9]结论一致，提示RA患者的铁储存并不缺乏，其贫血由炎症导致的比重更大。进一步比较RA患者中贫血与非贫血的患者可以发现，两组SI、SF均无统计学差异，这也说明RA患者的贫血并非由于铁缺乏导致。为更进一步分析，本研究采用sTfR/logSF指数将RA贫血患者分成两组进行比较。由于区分RA患者的ACD和ACD+IDA混合性贫血的诊断体系十分复杂，缺乏可靠的单一指标，Abdel等[7]认为在RA炎症性贫血时，其sTfR往往不高，而SF往往是正常或升高的，故设定sTfR/logSF指数＜1.5为单纯ACD，而sTfR/logSF指数≥1.5为ACD+IDA混合性贫血，这单一指数鉴别方法也被很多研究者采用[10]。本研究也采用此指数区分RA贫血患者，发现单纯ACD患者占52.5%，ACD+IDA混合性贫血患者则为47.5%；ACD组的血清SF水平及DAS28评分均明显高于IDA+ ACD组，而RBC、HGB、SI在两组间无统计学差异。因此，在RA患者中，ACD是主要的贫血类型，缺铁并不是导致贫血的主要因素，推测疾病活动导致的相关炎症反应才是引起并加重贫血的主要因素。

Hepc是铁代谢的关键因子，在维持机体铁稳态中发挥着关键性作用，其受血清铁水平和细胞内铁储存状态的调节，当机体铁过多时将刺激Hepc生成，进而阻止肠道铁吸收，减少巨噬细胞释放细胞内储存铁，防止铁超载发生；而缺铁时将抑制Hepc生成，通过增加肠道铁吸收，促进细胞内储存铁释放，来弥补机体铁不足。铁和Hepc的这种反馈调节环路确保了机体铁稳定。因此，Hepc过多可导致铁利用障碍性贫血，而Hepc过少可导致肝或其他实质性脏器铁沉积[2]。近年来的研究发现Hepc水平还受炎症的调节[11]，炎症可以刺激Hepc的生成，Nemeth等[12]和Lee等[13]研究发现，IL-6是炎症时刺激Hepc的升高的主要炎症因子；已有学者发现在RA患者中Hepc水平与IL-6水平呈正相关，提示IL-6的升高导致了Hepc的升高，从而引起或加重RA患者的贫血[14]，说明在RA患者体内，Hepc不仅仅局限于受铁水平和贫血的调控，还受IL-6的调控，是IL-6的下游炎症因子之一。而BMP-6由骨髓间充质干细胞及造血干细胞生成[3]，有研究认为BMP-6在骨代谢中发挥重要作用[15]。而Qi等[4]与Atndt等[16]研究发现，BMP-6与Hepc及铁代谢有关；Qi等发现小鼠血清铁蛋白水平的升高可以同时上调肝脏表达的BMP-6及Hepc水平，而Atndt等进一步证实BMP-6可以不依赖IL-6而强烈诱导Hepc合成。Andriopoulos等[17]的研究进一步表明，BMP-6不仅是IL-6上调Hepc的关键性信号因子，还直接参与了铁代谢，可以感应到机体内铁水平的变化，在SI水平下降时随之降低并下调Hepc生成，SI升高时上调Hepc的生成。但目前关于BMP-6及Hepc关系的研究很少，且多局限于动物实验和体外实验，在RA患者中的研究需要进一步的探索。本研究结果发现，RA患者的血清BMP-6与DAS28评分、SI、IL-6及Hepc均存在正相关，符合Andriopoulos的研究推论[17]，推测IL-6和BMP-6、Hepc为同一个信号通路上的因子，共同参与了RA的炎症。

一般情况下，RA患者贫血高发，HGB明显降低，血清BMP-6及Hepc也应该降低，但本研究结果发现，RA患者血清Hepc、BMP-6水平明显高于SLE患者及健康对照组，提示BMP-6及Hepc在RA中存在异常的作用机制。进一步分析发现，RA患者中疾病高度活动组血清Hepc、BMP-6水平明显高于疾病非高度活动组，而HGB则降低；同时，RA伴贫血患者的IL-6水平及DAS28评分均明显升高，而血清BMP-6及Hepc与非贫血组间均无统计学差异。这些结果进一步提示，RA患者BMP-6及Hepc水平不受HGB的调控，而在疾病高度活动时，RA相关的炎症反应还上调了Hepc和BMP-6水平，同时加重了贫血。在RA合并贫血的患者中还发现单纯ACD组的Hepc、BMP-6水平均高于IDA+ACD组，但两组的HGB水平并无差异。这也说明，RA患者BMP-6和Hepc水平异常升高后在不缺铁的患者中可能促进了贫血的发生，其作用相当于缺铁导致的促贫血作用，进一步提示BMP-6及Hepc水平在RA中受到炎症的调控，不仅失去了对贫血的感应，还反过来促进了炎症性贫血，而根据Nemeth等[12]和Lee等[13]的研究结论，推测这些作用很可能正是通过IL-6介导的。大量研究已经证实了IL-6在RA发病机制中的重要作用，Hashizume等[18]也认为IL-6正是诱导RA患者中Hepc生成并进一步导致ACD的主要炎症因子。那么，根据这些结果，可以推测在RA患者疾病活动时，由于IL-6的刺激和诱导作用，血清BMP-6及Hepc均明显升高，这种明显的上调作用干扰了BMP-6及Hepc对贫血和铁代谢的正常感应及调节作用，直接导致了铁代谢紊乱及ACD的发生。因此在RA患者中，IL-6、BMP-6及Hepc作为同一条信号通路上的炎症因子，是诱导RA患者发生ACD的主要因素。为进一步证实BMP-6及Hepc在RA贫血发病机制中的作用，本研究还分析了RA患者血清BMP-6与Hepc之间及它们与其他贫血相关因素之间的相关性，结果发现RA患者的血清Hepc与BMP-6呈正相关，且两者均与IL-6、疾病活动性评价指标DAS28评分呈正相关，而与RBC、HGB及SF均不相关，也从另一个角度证实了笔者的推测，说明在RA患者中，BMP-6及Hepc作为铁代谢调节因子对贫血和铁水平的调控作用受到了炎症的干扰，而使其更多地是作为炎症因子发挥作用并导致了ACD的发生。

Koca等[19]研究发现RA患者的Hepc水平比SLE患者明显升高，SLE患者的Hepc水平无升高。本研究结果也发现SLE患者的Hepc水平与对照组无差异，与上述结论一致；同时，SLE患者的BMP-6水平也明显低于RA，与健康对照组无差异。因此，笔者推测BMP-6和Hepc的异常升高可能在RA患者中表现更明显，这可能与IL-6在RA中的作用有关，也可能正是RA患者贫血发生率高于SLE的原因所在。但由于SLE患者的BMP-6相关研究欠缺，且本研究中SLE患者样本量较小，故上述推论尚需进一步证实。

综上所述，RA患者的贫血发生率高，且缺铁并不明显，其贫血类型以ACD为主。RA患者的血清BMP-6和Hepc水平均明显升高，相互之间关系密切，且均与IL-6和疾病活动性呈正相关，推测在RA患者疾病活动时，由于IL-6的刺激和诱导作用，BMP-6及Hepc失去了对贫血和铁代谢的正常感应及调节作用，而是作为炎症因子导致了铁代谢紊乱和ACD的发生。IL-6、BMP-6及Hepc作为同一条信号通路上的炎症因子，是诱导RA患者发生ACD的主要因素。BMP-6和Hepc可能可以作为RA患者ACD治疗的靶点，其在RA中的作用机制值得进一步研究探索。

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Association of serum bone morphogenetic protein-6 and hepcidin levels with anemia in patients with rheumatoid arthritis

Objective To investigate the association of serum bone morphogenetic protein-6(BMP-6)and hepcidin (Hepc)levels with anemia in patients with rheumatoid arthritis(RA).Methods Blood samples were collected from 99 patients with RA，19 patients with systemic lupus erythematosus(SLE)and 40 healthy controls.Serum BMP-6,Hepc and IL-6 were measured by ELISA,and serum iron(SI),ferritin(SF),soluble transferrin receptor(sTfR)levels were also determined.The correlation of BMP-6 and Hepc levels with anemia and disease activity score for 28 joints(DAS28)was analyzed by SPSS software.Results In 99 RA patients,59(59.6%)were complicated with anemia,including 30 patients(52.5%)with anemia of chronic disease(ACD)having sTfR/logSF index value＜1.5,and 29(47.5%)with anemia of chronic disease and coexistent iron deficiency anemia(ACD+IDA) having sTfR/logSF index value≥1.5.Serum BMP-6 and Hepc levels in RA patients were higher than those in healthy controls or SLE(P＜0.05).DAS28 scores and serum IL-6 were higher in anemic RA patients than in RA patients without anemia (P＜0.05), but no differences were observed in levels of SI,SF,BMP-6 and Hepc between two groups.The levels of SF,BMP-6,Hepc and DAS28 score was higher in RA patients with ACD than those in RA patients with ACD+IDA(P＜0.05).Hemoglobin levels in RA patients with high DAS28 scores(＞5.1)were lower than those with low DAS28 scores(≤5.1),while serum BMP-6 and Hepc levels were higher in RA patients with high DAS28 scores than those with low DAS28 scores(P＜0.05).In RA patients,the level of serum BMP-6 was positively correlated with Hepc,IL-6,SI and DAS28 scores(P＜0.01).And the level of serum Hepc was positivelycorrelated with IL-6 and DAS28 scores(P＜0.05).Conclusion The serum levels of BMP-6 and Hepc are high in RA patients,especially in patients with ACD or high DAS28 scores.The correlation between BMP-6,Hepc and IL-6 suggests that BMP-6 and Hepc may induce ACD in RA and might be used as therapeutic target for ACD in RA.

Rheumatoid arthritis Hepcidin BMP-6 Anemia