浙江地区汉族人群IL-27p28基因多态性与克罗恩病的相关性研究

2013-04-17王立英陈春晓朱新建项利娟

浙江医学 2013年18期

王立英陈春晓朱新建项利娟

王立英陈春晓朱新建项利娟

目的探讨IL-27p28基因启动子区g.-964 T＞C、第2外显子区g.2905T＞G和第4外显子区g.4730T＞C 3个位点的多态性与浙江地区人群克罗恩病（CD）的相关性。方法选取75例浙江地区汉族CD患者（病例组）及80例健康体检者（对照组），采用聚合酶链反应-连接酶检测，分析两组基因型频率及等位基因频率。结果对照组的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。两组g.-964位点的基因型频率及等位基因频率的差异有统计学意义（P＜0.05），而g.2905和g.4730位点的基因频率及等位基因频率的差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 IL-27p28基因多态位点g.-964 T＞C可能与浙江地区汉族人群CD易感性有关，g.2905T＞G和g.4730T＞C多态性与浙江地区汉族人群CD无关。

IL-27p28 基因多态性克罗恩病

克罗恩病（CD）是一种慢性非特异性胃肠道炎症性疾病，其病因和发病机制尚未完全阐明，目前认为是由环境、遗传、感染、免疫等多种因素相互作用所致。近年来研究发现，肠道黏膜免疫异常在炎症性肠病（IBD）发生、发展过程中起重要作用[1]，其中细胞因子调节在介导这一免疫反应异常中扮演重要角色。IL-27是新近发现的IL-12家族成员之一，与IL-12具有相似的结构和生物学功能，参与多种免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等疾病的免疫调节过程[2]。目前已知，IL-27p28基因的3个多态性位点分别为：启动子区g.-964 T＞C、第2外显子区g.2905T＞G和第4外显子区g.4730T＞C。2009年，Li等[3]韩国学者发现，位于IL-27p28基因多态性可能与韩国人群CD易感性相关。笔者在这一发现的基础上通过分析该位点多态性，探讨其与浙江地区汉族人群CD发病的相关性，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象选取2007-01—2011-12在浙江大学医学院附属第一医院（40例）和上虞市人民医院消化内科（35例）就诊或住院且临床资料完整、彼此无血缘关系的75例汉族CD患者，其中男41例，女34例，年龄8～67岁，平均（37.43±12.45）岁；平均病程（5.37±4.29）年；CD活动指数183.47±53.61。选择同期健康体检者80例作为对照组，其中男45例，女35例，年龄18～60岁，平均（36.21±11.54）岁。CD的诊断标准参照中华医学会消化病学分会炎症性肠病协作组制定的《中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》[4]。排除标准：（1）非汉族人口；（2）合并其他自身免疫性疾病；（3）严重心、肺、肝、肾功能损害和神经、精神疾病；（4）糖尿病以及其他内分泌系统疾病；（5）近期有明确感染病史：近1个月曾使用糖皮质激素；近3个月曾使用免疫抑制剂；（6）服用避孕药的育龄女性、孕期和哺乳期妇女；（7）创伤患者。本研究经浙江大学医学院附属第一医院和上虞市人民医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。两组性别、年龄的差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取采集EDTA抗凝静脉血2ml，使用临床样品基因组DNA小量抽提试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）提取白细胞基因组DNA，溶解于TE缓冲液，定量后-20℃保存。

1.2.2 聚合酶链反应-连接酶检测（PCR-LDR） IL-27g.-964T＞C、g.2905T＞G和g.4730T＞C位点多态性采用PCR-LDR技术分析。PCR扩增反应体系为基因组DNA 1μl、上下游引物各0.25μl（10μmol/L）、Taq酶0.2μl、10×PCR缓冲液2μl和 dNTPs 0.3μl（2.5mmol/ L），加去离子水至15μl，先94℃预变性2min，再94℃变性20s，62℃退火20s，72℃延伸40s，共进行40个循环，最后72℃3min。以上PCR产物2μl，10×Taq DNA连接酶缓冲液1μl，Taq DNA连接酶（40U/μl）0.125μl，每条探针（10bp）0.01μl，加去离子水至10μl。先94℃30s，再60℃3min，共进行20个循环。取1μl连接产物，加2μl上样Loading Dye 95变性3min，立即冰水浴，测序仪（美国应用生物系统公司ABI 377型）检测。实验过程和基因型分析在上海捷瑞生物工程有限公司实验室实施。上下游引物、探针和产物大小见表1。

表1 引物、探针序列及产物长度

1.2.3 测序为验证检测方法的准确性，每1个位点均从所有样本中按随机数表法抽取5%的样本进行测序（委托生物芯片上海国家工程研究中心实验室实施）。

1.3 统计学处理采用SHEsis软件进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验，确定对照组是否可以代表浙江地区汉族群体。采用SPSS16.0统计软件，计数资料组间比较采用χ2检验，并采用logistic回归计算各位点的OR评估相对危险度，计算95%CI。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡吻合度对照组在g.-964 T＞C，g.2905T＞G和g.4730T＞C 3个多态位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，表明所收集的样本可以代表群体。

2.2 两组基因型频率、等位基因频率分析 IL-27p28基因检测结果显示，g.-964位点出现TT纯合、TC杂合和CC纯合，g.2905位点出现TT纯合和TG杂合，g. 4730位点出现TT纯合、TC杂合和CC纯合，两组g.-964位点的基因频率及等位基因频率的差异有统计学意义（P＜0.05），提示该位点的多态性可能与浙江地区汉族人群CD易感性有关；而g.2905和g.4730位点的基因频率及等位基因频率的差异无统计学意义（P＞0.05），提示该位点的多态性与浙江地区汉族人群CD易感性无关，详见表2。

3 讨论

目前认为，肠道黏膜免疫应答异常在炎症性肠病发病及病情加重过程中起重要作用，其中Th1/Th2细胞亚群之间的平衡失调是肠道黏膜免疫应答异常的关键因素。IL-27是新近发现的一种异源二聚体细胞因子,由特异的亚单位IL-27p28和EBI3组成[5]，与其受体结合后，通过激活JAK/STATs通路途径转导信号，引起特异的生物学反应[6]。IL-27在免疫反应过程中具有促炎和抗炎症反应的双重免疫调节作用。在T细胞增殖分化早期，IL-27通过STAT1、STAT3途径促进初始CD4+T细胞分化为Th1细胞，同时可协同IL-12促进初始CD4+T细胞分化为Th1细胞，及促进初始T细胞、NK细胞产生IFN-γ[7]；IL-27还可通过上调初始CD4+T细胞ICAM-1的表达，介导ICAM-1/LFA-1信号途径来促进Th1细胞分化[8]。Villarino等[9]在IL-27R-/-小鼠模型的研究证实了IL-27R缺乏可以降低结肠炎的发病率。这些研究充分证明了IL-27在CD的炎症进展过程中发挥重要的免疫调节作用，IL-27可能是CD易感性研究的一个重要的候选基因。

表2 两组基因型频率、等位基因频率分析[例（%）]

本研究中IL-27位点基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，说明选择样本具有群体代表性。本研究结果显示，两组IL-27启动子区g.-964 T＞C的基因型频率及等位基因频率分布的差异有统计学意义，提示该位点的多态性可能与浙江地区汉族人群CD易感性相关,这与Li等[3]的韩国IBD人群易感性研究结果相同。同时，虽然本研究中g.2905T＞G和g.4730T＞C 2个位点的基因多态性与浙江地区汉族人群CD易感性未发现有相关性，其原因可能有种族差异、样本数量不足等不确定因素，不排除这2个位点与其他人群CD具有相关性，也不排除IL-27基因其他位点与CD的发生具有相关性。

由于本研究病例数及地域较局限，故仍需行多中心大样本的队列研究，才能最终明确该基因多态性与中国汉族IBD发病的相关性，为进一步筛选中国人IBD的易感基因以及未来发展基因诊断和治疗提供依据。

[1]Sartor R B.Mechanisms of disease:pathogenesis of Crohn's disease and ulcerative colitis[J].Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol,2006,3(7):390-407.

[2]Shimizu M,Shimamura M,Owaki T,et al.Antiangiogenic and antitumor activities of IL-27[J].J Immunol,2006,176(12):7317-7324.

[3]Li C S,Zhang Q,Lee K J,et al.Interleukin-27 polymorphisms are associated with inflammatory bowel diseases in a Korean population[J].J Gastroenterol Hepatol,2009,24(10):1692-1696.

[4]中华医学会消化病学分会炎症性肠病协作组.中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见[J].中华内科杂志,2008,47(1):73-79.

[5]Pflanz S,Timans J C,Cheng J,et al.IL-27,a heterodimeric cytokine composed of EBI3 and p28 protein,induces proliferation of native CD4(+)T cell[J]．Immunity,2002,16(6):779-790．

[6]Yoshida H．Immune regulation by IL-27 for therapeutic usage [J].Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi,2009,32(4):202-213．

[7]Takeda A,Hamano S,Yamanaka A,et al.Cutting edge:role of IL-27/WSX-1 signaling for induction of T-bet through activation of STAT1 during initial Th1 commitment[J].J Immunol,2003,170 (10):4886-4890．

[8]Owaki T,Asakawa M,Fukai F,et al.IL-27 induces Th1 differentiation viap38MAPK/T-bet-and intercellular adhesion molecule-1/LFA-1/ERK1/2-dependent pathways[J].J Immunol,2006,177 (11):7579-7587．

[9]Villarino A V,Artis D,Bezbradica J S,et al.IL-27R deficiency delays the onset of colitis and protects from helminth-induced pathology in a model of chronic IBD[J].Int Immunol,2008,20(6):739-752．

Association of IL-27p28 gene polymorphisms with Crohn's disease in Han population of Zhejiang province

Objective To investigate the association of IL-27p28 gene polymorphisms with Crohn's disease in Han population of Zhejiang province．Methods 75 patients with Crohn's disease and 80 healthy subjects from Han population of Zhejiang province were enrolled in the study.The g.-964 T＞C,g.2905T＞G and g.4730T＞C polymorphisms of IL-27p28 gene were analyzed by polymerase chain reaction-ligase detection reaction(PCR-LDR). Results The distributions of genotypes in both groups were fitted to Hardy-Weinberg equilibrium(P＞0.05)．There were significant differences in genotype and allele frequencies at g.－964T＞C site between patients and controls(P＜0.05),while those at g.2905 and g.4730 sites showed no significant differences between two groups(P＞0.05).Conclusion The polymorphism of IL-27p28 gene at-964T＞C site might be associated with the susceptibility to Crohn's disease in Han population of Zhejiang province,such association is not observed in sites 2905T＞G or 4730T＞C.

IL-27p28 Polymorphism Crohn's disease