DNA 修复转录因子TFIIH 与毛发硫营养障碍的研究新进展*

★ 熊瑛 雷玲 张吉翔 (南昌大学第二附属医院 南昌330006)

DNA 能经历不同的修饰，包括链断裂、碱基损伤、解旋核以及内源性或外源性链交联(前者由于活性氧化物，后者为紫外线照射)。为维持基因组的完整性及避免基因损害带来的负面影响，细胞具备一些化学性及遗传性的DNA 修复途径。损伤的DNA 如果无法修复，将会为人类带来一系列的机能紊乱，如发育缺陷、神经畸形、光过敏、癌症以及加速老化过程。核苷酸剪切修复是最重要的DNA 修复系统之一，它对消除由于抗致瘤药物以及紫外线照射所引起的某些DNA 损伤起着关键作用，比如环丁烷嘧啶(CPD)和嘧啶(6 －4)嘧啶酮产物(它们会破坏DNA 的螺旋结构)。核苷酸剪切修复障碍会导致一些少见的常染色体显性遗传疾病，如着色性干皮病、cockayne 综合症以及毛发硫营养障碍。11 种基因的突变与这些疾病相关。参与核苷酸剪切修复基因产物，和这11 个基因中的三种(XPB，XPD and p8/TTDA)，是组成转录/修复因子TFIIH 的基础部分［1］。今天，我们将详细阐述TFIIH 的分子功能及检测其功能损伤将导致毛发硫营养障碍。

1 毛发硫营养障碍遗传学特点

遗传互补实验揭示了光过敏毛发硫营养障碍患者是由于TFIIH 十个亚基中的三个，即XPD、XPB和p8/TTDA 突变所导致的。甚至在从毛发硫营养障碍患者中提取的细胞中发现，TFIIH 的细胞浓缩物也大大减少了。但是，无论是DNA 修复缺失的程度还是TFIIH 水平下降的程度都与临床表现型的程度无明显正相关。着色性干皮病患者的细胞中TFIIH 水平也显著下降。大部分光过敏毛发硫营养不良病例中，XPD 基因出现变异，其变异位置位于蛋白质末段的C 端或位于R112 环［2］。在这里必须指出，在部分病例中，相同的变异可导致不同的临床表现型，但是表型的严重程度则取决于等位基因的突变特性，这就告诉我们，等位基因可能促成了毛发硫营养障碍的临床表现型［3］。流行病学研究显示XPD 中p. H201Y，p. D312N 和p. K751Q 的多态性可能与肺癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌相关，但与类毛发硫营养障碍症状无关。在体外实验中进一步阐述了在体外包含XPD 多态性的TFIIH 复合物中存在正常的DNA 修复和基本转录。这个实验表明XPD 的单一多态性是良性改变，而不同多态性的复合体则有肿瘤化倾向［4］。在XPB 中发现3 个突变，其中只有T119P 突变会导致毛发硫营养障碍。p8/TTDA 是TFIIH 的第10 个亚基，它与光过敏毛发硫营养障碍的第三种类型相关。p8/TTDA 的突变，无论是L21P，R56 终止还是碱基T、C 之间的转变(在起始密码子)都将导致p8/TTDA 蛋白缺失［5］。TTDN1 被鉴定为非光过敏毛发硫营养障碍的第一个致病基因。在44 例非光过敏患者中只有6 例出现了基因突变。TTDN1 的碱基切除修复能力正常，其TFIIH 也在保持正常稳定水平［6］。临床表型的严重性与TTDN1 的突变无关，这说明非光过敏毛发硫营养障碍是多因子疾病，除了TTDN1 突变外的其他因素可能影响了该病表型。事实上，TTDN1 与polo－like 激酶1 相互作用通过Cdk1 的磷酸化在调节有丝分裂和胞质分裂中起作用［7］。

2 核苷酸剪切修复中的TFIIH 在毛发硫营养障碍中的作用

核苷酸剪切修复是一个至少需要2 个旁路的多步骤过程。一个是配对转录DNA 修复，一个是总体基因组修复，前者只在转录活化的DNA 链上清除损伤，后者则作用于基因组的任何序列。在真核细胞中，这个过程需要超过30 种蛋白用于可连续作用于损伤DNA 的蛋白:识别DNA 损伤、打开损伤DNA链、切开单链病清除损伤的DNA 片段、修补并连接DNA 复合物。人类TFIIH 核心部分为一个环形结构，由七个亚基组成:XPB、XPD、p62、p52、p44、p34和p8/TTDA，它与CDK 活化激酶(由Cdk7，cyclin H 以及MAT1 组成)相关。无论这个部位的损伤DNA 修补时通过XPC/HR23B 还是RNA 聚合酶II，TFIIH 都会通过募集XPG 及XPF 内源性核酸酶打开损伤DNA 链并加速损伤剪切清除。为使得DNA囊泡化，TFIIH 核心部分启动2 个具三磷酸水解功能的解螺旋酶蛋白，同时CAK 从核心部分释放至XPA 与其他核苷酸剪切修复因子附近［8］。虽然CAK 激酶活性通过RNA 聚合酶II 最大亚基的C 端和大量细胞核受体的磷酸化在基本转录过程中十分关键，但它对核苷酸剪切修复则不是必需的。

2.1 XPB 基因在毛发硫营养障碍中的作用

DNA 在损伤附近打开可能是通过XPB 的解螺旋酶活性驱动。近年来研究表明XPB 的解螺旋酶活性在核苷酸剪切修复中非关键因素。但是XPB的三磷酸腺苷酶活性在与XPD 解螺旋酶活性连接是清除DNA 损害所必需的。XPB 除了其7 个解螺旋酶基序中有1 个是三磷酸腺苷连接位点，还占据2 个额外的三磷酸腺苷激酶基序:保守R －E －D 残余环基序(氨基酸472 －474)和正电荷拇指(ThM)区域(氨基酸514 －537)。这些基序在XPB 的依赖DNA 三磷酸腺苷酶活性调节方面是具备特异性的，有助于TFIIH 与损伤DNA 的连接，并允许其他核苷酸剪切修复因子参与。纵使位于其他解螺旋酶/三磷酸腺苷激酶外的XPB/T119P 变异将扰乱TFIIH结构［9］。TFIIH 的另一个亚基P52 与XPB 相互作用，刺激其ATP 激酶活性。P52 的变异(Dmp52)，降低与XPB 相互作用的稳定性，将导致对紫外线敏感性大大增加、癌变倾向、毛发变脆、角质畸形和发育性缺陷［10］。P52 的突变可能破坏其与XPB 或其他DNA 修复转录因子在形态与功能上的相互作用。如果发生在人类的此类突变所致临床表型，我们称之为毛发硫营养障碍和着色性干皮病。

2.2 XPD 基因在毛发硫营养障碍中的作用

除XPB 外，TFIIH 包含了另一个DNA 解螺旋酶亚基XPD，它在核苷酸剪切修复过程中打开损伤附近的DNA 有至关重要的作用，而对转录起始则作用不大。最近对于XPD 结构研究显示，其包含了2 个规范解螺旋酶片段(HD1:解螺旋酶基序I，Ia，II，III;HD2:解螺旋酶基序IV，V ，VI)的1 个4 区域机构，铁硫簇连接和弓形片段。但是，XPD 结构部位的变异与毛发硫营养障碍的临床表型无关。广泛分布在4 个片段的毛发硫营养障碍变异可能会干扰不同TFIIH 亚基(这些亚基能影响TFIIH 复合物完整性)的相互作用［11］。尽管着色性干皮病患者的癌症发生率升高是由于核苷酸剪切修复障碍，但是不知道为何光过敏毛发硫营养障碍没有恶变倾向。答案可能就来源于免疫细胞化学的研究。在紫外线照射后，在完成大部分损伤DNA 修复后，核苷酸剪切修复因子会立即汇集在损伤位点并在整个细胞核内重新分布。损伤识别蛋白XPC 迅速集中在着色性干皮病和毛发硫营养障碍病患细胞中(在野生型细胞中亦然)。但是在着色性干皮病细胞中，XPC 将会在紫外线照射后24 小时后重新分配并因残留延迟募集TFIIH 复合物至损伤位点，而在毛发硫营养障碍细胞中，XPC 在3 小时就进行重新分配至损伤位点同时很难募集TFIIH 至DNA 损伤部位［12］。这些结果部分支持了假设:虽然着色性干皮病和毛发硫营养障碍都是由于核苷酸剪切修复缺陷导致，在毛发硫营养障碍中损伤位点核苷酸剪切修复复合物缺失，可能使得合成物反式损伤或复制后修复;而在着色性干皮病中，在不匹配位点出现的核苷酸剪切修复因子残留可能阻止了复制和/或转录过程，将导致基因组不稳定性及癌症发生率上升。XPB/p52、XPD 与P44 相互作用、TFIIH 的另一个亚基及其联合都会上调XPD 解螺旋酶活性而不是其三磷酸腺苷酶活性。大部分XPD 变异都位于其C 端并减弱其N 端与P44 的相互作用，这就是为何这些病人会出现核苷酸剪切修复。P44 像典型的泛素连接酶E3(P34 亚基也一样)具备一个指环片段，而Ssl1p(P44 同源芽酵母)显示出可影响转录的泛素连接酶E3 活性［13］。

2.3 p8/TTDA 在毛发硫营养障碍中的作用

p8/TTDA 是TFIIH 复合物中第10 个且是最小的亚基，其突变只导致毛发硫营养障碍。P52 能上调XPB 活性，p8/TTDA 在体外通过直接与P52 作用从而刺激XPB 的三磷酸腺苷酶活性［5］。XPB、P52和p8/TTDA 这三个亚基的相互联系作用已被大量遗传互补实验所证实。事实上，p8/TTDA 的过表达不仅在TTD － A 细胞、XPD 变异的TTD 细胞以及Dmp52(人类P52 同源体)变异的果蝇属细胞中都能重建TFIIH 正常水平［14］。这些实验都强调了P8作为TFIIH 稳定剂的作用，2 个孤立动态的p8/TTDA 池存在:一个与TFIIH 连接而另一个则是往返于胞浆和胞核的备用插入单元。溶液结构实验显示后一种形式就像一个同型二聚体。诱导DNA 损伤后，这两种p8/TTDA 池的平衡被打破，它们迅速替换成为TFIIH 复合物中一个更加稳定形式。结构研究显示p8/TTDA L21P 突变可能破坏其组成。甚至，R56终止子突变减弱了p8/TTD－A 与p52 的相互作用，最终将导致TFIIH 稳定性下降［15］。还有很多潜在的修饰TFIIH 复合物功能的途径，因而分析TFIIH各亚基的作用仍需进行大量的研究。分析翻译修饰后蛋白对大多数细胞周期、TFIIH 所经历的修饰途径以及这些修饰途径如何调节复合物活性具有重大意义，这些对于我们了解毛发硫营养障碍临床表型的分子基础有帮助:泛素蛋白酶体下调DNA 修复调节途径;XPB 与26S 蛋白酶体亚基SUG1 相互作用;MAT1 蛋白化作用调节CAK 活性;其他转录后修饰如XPB 磷酸化，通过阻止XPF－ERCC1 核酸内切酶介导的切开步骤，从而调节核苷酸剪切修复［16］。除了上述研究，揭示TFIIH 各亚基功能及修饰作用仍需进一步进行探讨。

3 毛发硫营养障碍与转录综合征

DNA 修复缺陷将导致毛发硫营养障碍、着色性干皮病、科凯恩氏综合征、血液病、沃纳综合症、Nijmegen 断裂综合征、细血管扩张性共济失调综合征等等疾病［1］。缺失DNA 修复甚至与神经障碍有关，核苷酸剪切修复活性在终末分化神经元中显著下降，这说明缺失DNA 修复经典模式下的神经退行性变促成DNA 损伤蓄积直至神经死亡。但是紫外线能深入穿透皮肤真皮而无法进入中枢神经系统，而且毛发硫营养障碍病人相较神经退行性变更受发育性缺陷的痛苦(如髓鞘形成障碍)，说明毛发硫营养障碍临床表型是由于转录缺陷引起。有研究表明核苷酸剪切修复因子与编码基因的转录蛋白相关。在毛发硫营养障碍患者细胞中找到XPD 突变的TFIIH，而着色性干皮病患者则无这一突变，显示其体外基本转录缺失。然而，毛发硫营养障碍和着色性干皮病的成纤维细胞微阵列基因表达分析表明无显著性差异。毛发硫营养障碍的症状主要是由于在分化细胞和特定组织中的转录存在明显差异的发育障碍引起的［17］。最近一项毛发硫营养障碍小鼠模型研究中提出在毛发硫营养障碍发病机制中TFIIH 的辅激活因子相当重要。携带了人类患者中的一个突变基因TTD/Xpd (R722W)突变体小鼠出现了相似的临床表型，如小脑畸形及硫化髓鞘形成，这些缺陷都是由于在中枢神经系统中甲状腺激素靶基因反常所导致的［18］。事实上，包含R722W 突变的TFIIH无法正确稳定甲状腺激素受体至其连接位点，导致该受体转录缺陷。XPD 其他突变减弱CAK 靶定至TFIIH 核心，其磷酸化PPARs，RARa 和/或VDR 配偶体能力下降，而激素敏感基因的高效表达必须经过磷酸化过程。初期光过敏与核苷酸剪切修复缺失相关，但是其他毛发硫营养障碍患者光敏感症状原因则是非常复杂的。除了TFIIH 变异及与之相关核苷酸剪切修复匮乏，近年来研究表明TTDN1 基因与非光过敏毛发硫营养障碍有关，该基因调节细胞有丝分裂及胞质分裂，而无其他机制与毛发硫营养障碍临床表型相关［19］。从光过敏和非光过敏毛发硫营养障碍细胞的深入研究可能可以提供为毛发硫营养障碍病理生理学研究提供新的线索，并揭开万能TFIIH 复合物朦胧而美丽的面纱。

［1］Lehmann A R. DNA repair－de?cient diseases，xeroderma pigmentosum［J］. Cockayne syndrome and trichothiodystrophy. Biochimie，2003，85(11):1 101 －1 111.

［2］Botta E. Genotype phenotype relationships in trichothiodystrophy patients with novel splicing mutations in the XPD gene［J］.Hum. Mutat，2009，30(4):438 －445.

［3］Andressoo J O.Rescue of progeria in trichothiodystrophy by homozygous lethal Xpd alleles［J］.PLoS Biol，2006，4，e322.

［4］Laine J P. Common XPD (ERCC2)polymorphisms have no measurable effect on nucleotide excision repair and basal transcription［J］.DNA Repair (Amst)，2007，6(9):1 264 －1 270.

［5］Giglia－Mari G et al. A new，tenth subunit of TFIIH is responsible for the DNA repair syndrome trichothiodystrophy group A［J］. Nat.Genet，2004，36(7):714 －719.

［6］Botta E. Mutations in the C7orf11 (TTDN1)gene in six nonphotosensitive trichothiodystrophy patients:no obvious genotype － phenotype relationships［J］.Hum. Mutat，2007，28(1):92 －96.

［7］Zhang Y. TTDN1 is a Plk1 －interacting protein involved in maintenance of cell cycle integrity［J］. Cell Mol. Life Sci，2007，64(5):632 －640.

［8］Schultz P et al. Molecular structure of human［J］. TFIIH. Cell，2000，102(5):599 －607.

［9］Oksenych V et al.Molecular insights into the recruitment of TFIIH to the sites of DNA damage［J］.EMBO J，2009，in press.

［10］Fregoso M. DNA repair and transcriptional de?ciencies caused by mutations in the Drosophila p52 subunit of TFIIH generate developmental defects and chromosome fragilityMol［J］.Cell Biol，2009，27(20):3 640 －3 650.

［11］Fan L.. XPD helicase structures and activities:insights into the cancer and aging phenotypes from XPD mutations［J］.Cell，2008，133(5):789 －800.

［12］Nishiwaki T .Comparative study of nucleotide excision repair defects between XPD － mutated ?broblasts derived from trichothiodystrophy and xeroderma pigmentosum patients ［J］. DNA Repair(Amst)，2008，7(10):1 990 －1 998.

［13］Burglen，L. The gene encoding p44，a subunit of the transcription factor TFIIH，is involved in large － scale deletions associated with Werdnig－ Hoffmann disease［J］. Am. J. Hum. Genet，1997，60(1):72 －79.

［14］Aguilar－Fuentes J.p8/TTDA overexpression enhances UV－irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model［J］.PLoS Genet，2008，4，e1000253.

［15］Vitorino M.Solution structure and self－association properties of the p8 TFIIH subunit responsible for trichothiodystrophy［J］. J. Mol.Biol，2007，368(2):473 －480.

［16］Kainov D E et al. Structural basis for group A trichothiodystrophy［J］.Nat. Struct. Mol.Biol，2008，15(9):980 －984.

［17］Compe E.Neurological defects in trichothiodystrophy reveal a coactivator function of TFIIH［J］.Nat. Neurosci，2007，10(12):1 414 －1 422.

［18］Compe E . Dysregulation of the peroxisome proliferator － activated receptor target genes by XPD mutations［J］. Mol. Cell Biol，2005，25(14):6 065 －6 076.

［19］Drane P.. Selective regulation of vitamin D receptor － responsive genes by TFIIH［J］.Mol. Cell，2004，16(1):187 －197.