乳酸菌与大肠杆菌相互作用的研究

2013-04-13董雪凤杨子彪任发政

中国乳业 2013年3期

文 / 董雪凤杨子彪任发政

（1云南大理来思尔乳业有限责任公司；2中国农业大学食品科学与营养工程学院）

大肠杆菌群是指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，一般不致病，为人和动物肠道中的常居菌，但在一定条件下可引起肠道外感染。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热，感染可能是致命性的。该菌对热的抵抗力较其它肠道杆菌强，在自然界的水中可存活数周至数月，是食品污染的主要来源[1]。

目前，我国奶牛主要以家庭小规模饲养为主，牛舍设施不良，挤奶和收奶过程不规范，加之牛奶营养丰富，很容易造成原料奶的污染，被普遍认为是致病性大肠杆菌的主要污染来源[2]。乳酸菌对大肠杆菌有一定的抑制作用[3]，可以用来提高乳制品的安全性。另外原料奶中污染大肠杆菌也会影响酸奶发酵剂的性能，从而影响发酵乳的质量。本文针对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌种对大肠杆菌的抑制作用和大肠杆菌对乳酸菌的影响进行了研究，为乳酸菌在发酵乳中的应用提供了更多的科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 乳酸菌

保加利亚乳杆菌L5、嗜热链球菌G7，由云南大理来思尔乳业提供。

1.1.2 大肠杆菌

从乳品中分离。

1.1.3 试剂

（0.1000±0.0002） mol/L氢氧化钠标准溶液、0.5%酚酞指示剂、95%乙醇、浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜、30 g/mL硼酸溶液、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂、0.0500 mol/L硫酸标准溶液、40%氢氧化钠溶液、邻苯二胺、浓盐酸等，除特殊标注的试剂外，均为国产分析纯试剂。

1.1.4 脱脂奶RSM（12%，W/V）

无抗生奶加无抗奶粉脱脂（奶粉添加量为脱脂后固形物含量的12%）， 115 ℃灭菌15min。

1.1.5 M17培养基

酪蛋白胨5 g、聚蛋白胨5 g、植物蛋白胨5 g、酵母浸膏2.5 g、牛肉膏5 g、磷酸甘油10 g、硫酸镁0.25 g、维生素C 0.5 g、蒸馏水950 g；pH值7.1～7.2；121 ℃灭菌15 min。

1.1.6 MRS培养基

pH值6.2～6.4，固体培养基加琼脂粉，121 ℃灭菌15 min。

1.2 仪器和设备

SNB-1数字粘度计、KDY-9830凯氏定氮仪、pH211精密酸度计、DGF30121电热鼓风干燥箱、LRH-250A生化培养箱、AL204电子天平净化工作台、QL-901混合器、XS-212-201显微镜。

1.3 乳酸菌对大肠杆菌的抑制作用

1.3.1 琼脂平板

取样品10 mL，无菌条件下1 500 rpm离心10 min，收集上清液。将已灭菌的滤纸片放入上清液中，浸泡10 min后，备用。取100 μL不同浓度大肠杆菌24 h乳糖胆盐培养物，涂布于伊红美蓝琼脂平板上。然后将带有乳酸菌上清液的滤纸平整地置于含有不同浓度大肠杆菌的伊红美蓝琼脂平板上，4 ℃扩散过夜，置于37 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径大小[4～5]。

1.3.2 RSM培养基

将不同活力的乳酸菌样品与不同浓度的大肠杆菌同时接种于RSM培养基中，发酵不同时间，取出，分别作大肠杆菌最近似值数的检测[6]。

1.3.3 乳酸菌的活力

取脱脂奶RSM培养基10 mL，将待测发酵剂按3%接种量接入脱脂乳中，37.8 ℃恒温培养3.5 h。取出加入20 mL蒸馏水及2 mL 1%的酒精酚酞指示剂，用0.1 M氢氧化钠溶液滴定至粉红色，30 s不褪色，记录消耗氢氧化钠的体积数，按下式计算：乳酸菌的活力=0.1 M氢氧化钠的体积数×0.009×10×1.0290%。

1.4 大肠杆菌对乳酸菌的影响

取保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌（1∶1）混合乳酸菌样品100 mL，按3%的接种量接种于脱脂奶RSM中，并加入1%的大肠杆菌，42 ℃发酵。凝乳后置于4 ℃冰箱中，24 h后，取出按3%的接种量接种于脱脂奶RSM中，42 ℃发酵，凝乳后4 ℃贮存。如此反复，每反复1 次算1 代，取2、4、6 代乳酸菌和大肠杆菌混合培养物与原乳酸菌样品进行对比。

将2、4、6 代乳酸菌样品与原样品分别作乳酸菌加工物性研究，具体指标和方法为：

1.4.1 产酸能力的测定

乳酸菌的产酸能力以单位时间pH值的变化（ΔpH）为评价指标。将原乳酸菌样品与2、4、6 代乳酸菌和大肠杆菌混合培养物以3%的接种量接种到10 mL已灭菌的RSM中，于37 ℃条件下培养。分别使用pH计在0、1、2、3、4和5 h测定凝乳的pH值。

1.4.2 产香能力的测定[7]

将原乳酸菌样品与2、4、6 代乳酸菌和大肠杆菌混合培养物以3%的接种量接种到100 mL已灭菌的RSM中，于37 ℃条件下培养3 h后取出，放置在4 ℃下保存，24 h后测定酸乳中的联乙酰含量。

1.4.3 水解蛋白能力的测定

将原乳酸菌样品与2、4、6 代乳酸菌和大肠杆菌混合培养物以3%的接种量接种到已灭菌的RSM中，于37 ℃条件下培养。当凝乳的pH值下降到4.6时取出，放置在4 ℃下保存。7 天后测定酸乳中的可溶性氮。

1.4.4 产粘能力的测定

将原乳酸菌样品与2、4、6 代乳酸菌和大肠杆菌混合培养物以3%的接种量接种到已灭菌的RSM中，于37 ℃条件下培养。当凝乳的pH值下降到4.6时取出，立即用流水将其温度降到（30±1）℃，使用粘度计测定凝乳的粘度值。

1.4.5 噬菌体检测[8]

用双层平板法，观察有无噬菌斑的形成。

表1 乳酸菌抑菌作用结果

表2 不同发酵时间液体培养抑菌试验结果单位：CFU/mL

2 结果与讨论

2.1 平板培养抑菌试验

以不同浓度大肠杆菌作指示菌，用不同活力的混合乳酸菌进行平板培养的抑菌试验，结果都有不同程度的抑菌效果，抑菌圈都在1.2～1.8 cm之间，效果更为显著的是混合乳酸菌，活力为0.84%。大肠杆菌浓度在1∶100的平板抑菌，其抑菌圈均为1.8 cm。试验结果见表1。

将不同活力混合乳酸菌试验结果作比较，发现混合乳酸菌活力强，抑制作用强。同样，将相同活力的乳酸菌作抑菌片，放入不同浓度的大肠杆菌平板平皿中，结果显示大肠杆菌浓度低的抑制作用强。

2.2 液体培养抑菌试验

取不同活力的混合乳酸菌样品，按3%的接种量接种于RSM培养基中，分别加入1%、2%、3%的大肠杆菌，在42 ℃条件下发酵3、6、9、12、15、18、21、24、27 h。依照国标GB 4789.3—94大肠菌群的检验方法，检测液体培养基RSM中大肠菌群的最近似值。试验结果见表2。

从表2中可以看出，不同活力的乳酸菌中加入一定数量的大肠杆菌后，随着发酵时间的延长，大肠杆菌数量逐渐减少，最终被抑制；相同活力的乳酸菌中加入不同质量分数的大肠杆菌，发酵相同的时间，大肠杆菌浓度低的，检测出的大肠杆菌数量也少，大肠杆菌浓度高的，检测出的大肠杆菌数量多；不同活力的乳酸菌，发酵时间相同，活力高的检测出的大肠杆菌数量少，活力低的乳酸菌检测出的大肠杆菌数量相对多[9]。

表3 不同代数产酸能力表（以pH值表示）

表4 菌株的生长及加工特性

2.3 大肠杆菌对乳酸菌的影响

取乳酸菌样品和2、4、6 代乳酸菌和大肠杆菌混合培养物，分别作菌种产酸率、生长能力、产粘能力、水解蛋白能力、产香能力的研究。原乳酸菌和2、4、6 代乳酸菌和大肠杆菌混合培养物产酸能力见表3。

从表3中可以看出，相同的起始酸度，同样的接种量，发酵相同的时间，随着大肠杆菌在乳酸菌中时间的延长，乳酸菌的产酸能力逐渐减弱。

在酸奶生产中，菌种的筛选具有非常重要的意义，扮演着至关重要的角色。菌种的选择直接关系到酸奶的质量、粘度、风味以及酸奶的多种功能特性。选择产酸力适中，产香性能高，有适当蛋白水解性的菌株，有利于形成具有良好功能特性的产品。产酸力适中，便于酸奶的凝固，抑制后酸的上升，延长酸奶的货架期。产香性能高，可使形成的酸奶具有浓郁的香味，有利于终产品良好风味的形成。酸奶中的羰基化合物，主要是联乙酰、乙醛等，它们以一定的比例存在，是构成酸奶风味的基础物质。Bottazzi（1983）的研究表明，联乙酰在酸乳中含量在5 mmol/L以下可产生良好的风味。发酵剂分解酪蛋白产生肽和氨基酸，对酸奶的成熟及风味的产生有着重要的作用。因此产酸能力、产粘能力、产香能力、水解蛋白能力、生长能力为酸奶发酵剂菌种的重要指标。

从表4中可以看出，原乳酸菌经大肠杆菌污染后，产香能力从（4.441±0.012）mg/L降到（3.854±0.011）mg/L，产粘能力从（2.89±0.01）pa.s降到（2.89±0.01）pa.s，酸奶硬度也逐渐降低，而水解蛋白能力几乎不受影响。用双层平板试验，结果2～4 代样品不受噬菌体的感染。