双歧杆菌对环境胁迫应答机制的研究进展

（中国农业大学教育部-北京市共建功能乳品重点实验室）

双歧杆菌是存在于人类和动物肠道菌群中的一种严格厌氧的革兰氏阳性细菌。该细菌是人类的主要益生菌种属之一，具有增强机体免疫力、维持肠道正常菌群平衡、改善小肠结构、润肠通便及延缓衰老等益生功能。因此，近几年来与双歧杆菌及其促生长因子有关的食品引起越来越多的关注[1]。

在生产加工、消化吸收的过程中，双歧杆菌面临着多种胁迫环境。首先，双歧杆菌必须抵御工业生产中遇到的热激、低水分活度、高渗及氧等各种胁迫；其次，双歧杆菌进入消化系统后，需要抵御胃部的酸性环境和小肠的高浓度胆盐等胁迫，才能以足够量的活菌数到达结肠发挥益生功能[2]。因此，对胁迫耐受力强的菌株将有更广阔的产业化应用前景。

根据已有报道，目前提高益生菌胁迫耐受性主要有两种方法：一种方法是将益生菌在亚致死条件下进行诱导，使其产生胁迫耐受应答反应，增强其胁迫耐受力，提高其在致死胁迫条件下存活率[3～6]；另一种方法是从胁迫环境中筛选出胁迫耐受力强的菌株[7～10]。最近的研究表明，在胁迫条件下筛选出来的益生菌菌株能够适应生产加工中存在的胁迫环境[11]。这两种提高益生菌胁迫耐受性方法的实质是通过诱导或筛选使益生菌的胁迫应答反应增强，因此研究双歧杆菌的胁迫应答机制对于开发高胁迫耐受性的双歧杆菌具有重要意义。

近些年来，有学者通过蛋白质组学等方法研究了益生菌的胁迫应答分子机制[5，12～14]，并且鉴定出一些与胁迫应答相关的基因[15～16]。本文根据已有研究报道，对双歧杆菌在生产加工及人体胃肠道中的胁迫应答作了简要综述。

1 双歧杆菌对生产加工过程中胁迫的应答

喷雾干燥是含有益生菌产品加工过程中常用工艺，这会使细菌暴露于高温而且有氧的环境下[17～18]，对益生菌的氧、热胁迫耐受性造成了极大的挑战。另外，当含有益生菌产品基质中有其它微生物存在时，又会对益生菌的生存造成竞争胁迫。首先针对双歧杆菌在氧胁迫、高温胁迫及竞争胁迫下的应答机制的研究进行综述。

1.1 氧胁迫

双歧杆菌属于厌氧菌，对氧气敏感。在氧气存在时，细菌胞内会形成等活性氧，而双歧杆菌缺少有效的活性氧清除机制，使活性氧在细胞内积累，进而造成DNA及蛋白质等分子的氧化损伤，导致细胞死亡[19]。然而不同的双歧杆菌菌株对氧的敏感性有差异。通过对现有的菌株间耐氧性差异的研究发现，双歧杆菌的耐氧机制包括如下几方面。

首先，双歧杆菌的耐氧机制与NADH氧化酶和NADH过氧化物酶有关系。该酶在乳酸菌中参与如下反应[20～21]：

乳酸菌通过两个途径将O2转化成无毒的H2O，途径一：通过反应3，直接将O2转化成H2O；途径二：先经过反应2，将O2转化成H2O2，再经过反应4，将H2O2转化成H2O。NADH氧化酶普遍存在于乳酸菌中，乳酸菌的NADH氧化酶主要指NADH-H2O2氧化酶和NADH-H2O氧化酶。只有一些乳酸菌中具有NADH过氧化物酶[22]。双歧杆菌通常具有NADH氧化酶和NADH过氧化物酶活力，由此推想，双歧杆菌利用这两种酶、通过这两条途径，进行氧胁迫应答，提高了耐氧性。

其次，双歧杆菌的耐氧机制与SOD（超氧化物歧化酶）有关系。该酶可将氧化活力较高的O2-转化成活力较低的H2O2，参加如下反应：

SOD参与双歧杆菌的耐氧机制，主要通过如下途径：先经过反应1，将O2转化成O2-，再经过反应5，将O2-转化成H2O2，最后经过反应4，将H2O2转化成H2O，起到了清除活性氧的作用[19]。

再次，双歧杆菌的耐氧机制还与环丙烷脂肪酸（CFU）有关。CFU是多数细菌细胞膜磷脂的重要组成部分。细菌的CFU通常在稳定初期，由细胞膜磷脂上的不饱和脂肪酸（UFA）与S-腺苷甲硫氨酸在环丙烷脂肪酸合成酶作用下形成[23]。这一反应增强了细胞膜的稳定性，进而提高了细菌的耐氧性。

有关双歧杆菌氧胁迫的机制还在不断的研究中。Yilei Qian等研究发现，当培养基中缺乏还原剂-半胱氨酸时，双歧杆菌面临氧胁迫，胞内积累的多聚磷酸盐含量增多，同时对酸胁迫的耐受力增强[24]。为了提高双歧杆菌Bifidobacterium longum 105-A对氧胁迫的耐受力，Robert Matsul等将Bacillus subtilis过氧化氢酶基因KatE导入双歧杆菌，结果发现转化株的耐氧能力有所提高[25]。

1.2 热激

热激是双歧杆菌在生产加工中遇到的另一种胁迫，有关它的研究很多。当热激发生时，一些双歧杆菌如B.longum、Bifidobacterium adolescentis和Bifidobacterium breve中的几种热激蛋白，如分子伴侣蛋白（如DnaK）、与DNA和RNA合成及细胞分裂相关的蛋白质的表达量增加[26]。B.longum NCC2705和B.breve UCC2003的基因序列信息已知，很多学者将这两株菌作为热激应答的研究对象。B.longum NCC2705在热激处理下（50 ℃下，3，7，12 min）全转录组分析显示，有46%的基因表达量发生改变[27]。已有学者通过蛋白质组学的方法研究了该菌株中分子伴侣蛋白系统（DnaK，GroEL和HtrA）[28]。菌株NCC2705也通过诱导smpB基因的表达来应对热激胁迫，smpB负责编码与tmRNA相关的小蛋白B，因此，smpB与tmRNA基因的表达量同时上调[27]。将野生株B.longumNCC2705及其耐热诱变株NCC2912的蛋白质图谱进行对比，分析发现有19 种蛋白质的表达水平有差异。其中，有些蛋白质参与了葡萄糖代谢、蛋白质合成等，另外还有一些蛋白质是热激蛋白[28～29]，如分子伴侣蛋白和蛋白酶，主要是ClpC、ClpA/B、GrpE、DnaK和Fk506结合蛋白[29]。最近的研究结果表明，在热激条件下dnaK操纵子负责调控的hspR基因发生突变，这种突变影响了hsp结合到dnaK启动子上的能力，导致DnaK分子伴侣蛋白表达量上调[30]。

在B.breve的热激应答中，分子伴侣蛋白发挥主要的作用。Ventura等发现，当面对热激时，菌株UCC2003通过过量表达两组分子伴侣蛋白来进行应答。第一组蛋白质参与温和的热激应答，包括GroEL、GroES、ClpC和ClpPs；第二组参与剧烈的热激应答，包括DnaK、GrpE、DnaJ和ClpB[16]。另外，编码一些小热激蛋白家族的基因hsp20在热激后也会过量表达[31]。

1.3 其它微生物的竞争

另一个双歧杆菌在生产加工中需要面对的胁迫是食品基质中多种微生物的竞争。营养物质竞争及抗菌代谢物（主要是有机酸）的积累，能够影响微生物的生长和功能发挥。Ruiz等通过双向电泳的方法研究发现，B.longum和B.breve共同培养与单独培养相比，有16 种蛋白质表达量发生改变[32]。这些蛋白质包括核糖体蛋白和参与碳水化合物代谢、基因调控、细胞壁生物合成和运输的蛋白质。显然，其它菌及发酵剂的存在会影响特定益生菌的生理功能。

2 双歧杆菌对胃肠道中胁迫的应答

双歧杆菌为了在人类胃肠道中定殖，需要克服酸胁迫、胆盐胁迫等许多不利环境，在此过程中双歧杆菌启动了一系列胁迫应答机制。

2.1 酸胁迫

口服双歧杆菌首先要经历的是pH值接近2.0的胃部酸环境，这将大大减少菌体的存活数量。通常，除动物双歧杆菌外，双歧杆菌耐受酸胁迫的能力很差[8，33]。一个很好的方法是筛选耐酸性强的菌株，因为它可以增强对其它胁迫因素的交互抗性，既包括人类胃肠道中的胁迫，也包括工艺生产中的胁迫[7，34]。在双歧杆菌暴露于亚致死酸环境后，菌体产生耐酸应答效应，该效应使双歧杆菌在致死的pH值环境下的胁迫耐受能力增强[35]。

目前已有研究表明F0F1-ATPase与双歧杆菌的耐酸性有关，该酶活性越高，双歧杆菌耐酸性越强，推测双歧杆菌可能利用该酶的质子泵功能将H+排出胞外[13，36～38]；另有研究表明，在酸胁迫状态下，双歧杆菌的氨基酸代谢相关酶表达量升高，胞内NH4+累积量增多，说明双歧杆菌可能利用氨基酸答谢产生NH3，中和胞内多余H+[39]。为进一步探讨双歧杆菌的耐酸应答机制，还有学者利用RNA-seq技术研究了双歧杆菌在耐酸应答中全基因组转录水平变化。结果表明，有500 余个基因表达水平在耐酸应答中发生改变，对这些基因功能进行分析发现，除利用上述两种酸胁迫应答机制外，双歧杆菌可能通过活跃半胱氨酸-硫胱醚代谢循环来产生NH3，中和胞内多余H+；另外，与DNA和蛋白质保护及修复相关的基因表达量升高，来避免H+对胞内大分子的损伤。除150 个基因与直接抵御H+胁迫有关，其余近400个基因的表达变化原因无法被明确解释，其中包括群体感应系统LuxS/AI-2中的luxs基因，部分蛋白激酶编码基因及转录调节蛋白编码基因。

2.2 胆盐胁迫

胆盐胁迫是双歧杆菌在胃肠道中必须克服的第二道生理屏障。双歧杆菌通过胆盐胁迫应答能够形成具有稳定表型的耐胆盐菌株[40]，同时对其它胁迫的耐酸能力增强[8，9，36，41]。另外，双歧杆菌胆盐胁迫耐受性与其碳水化合物代谢特征[8，9，41，42]，壁膜膜脂质和蛋白质组成[8，42]，以及与肠道病原菌竞争能力有关[43，44]。

脂质组成、膜蛋白特征和细胞壁功能在双歧杆菌耐胆盐胁迫中发挥着重要的作用[8，42，45]。产生胞外多糖是双歧杆菌抵御胆盐胁迫的一种机制[46，47]，最近的研究表明，胞外多糖的产量和胆盐胁迫耐受力之间有直接关系[46]。此外，胆盐胁迫抑制了动物双歧杆菌（B.animalis subsp.lactis）中与脂肪酸和磷脂合成有关酶的表达[14]。细胞膜脂质组成的改变降低了胆盐向细胞质扩散的速率，提高了菌体胆盐耐受力。根据已有研究结果，有如下推测：双歧杆菌的表面相关蛋白，如一些粘附素，在受胆盐胁迫时表达量会增加。这些蛋白质能增强双歧杆菌在人类肠道中的定殖[48]。

细胞膜是胆盐的主要靶位点之一，细胞能够通过细胞膜上外排泵解除胆盐的毒性。双歧杆菌中已报道了两个胆盐外排泵——Ctr和BetA，它们与胆盐的耐受性有直接联系[49]。不同的双歧杆菌对胆盐胁迫应答的机制不同[14]。长双歧杆菌（B.longum）中大多数与糖酵解途径相关的酶在胆盐胁迫时会过量表达，而动物双歧杆菌（B.animalis）中仅有几种酶表达量会上调，如木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸转酮酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶。这一研究结果说明，在应对胆盐胁迫时，长双歧杆菌（B.longum）消耗葡萄糖的能力增强，而动物双歧杆菌（B.animalis）的葡萄糖消耗能力减弱。

动物双歧杆菌（B.animalis）胆盐耐受力还与胆盐水解酶产量和活性有关[50]。胆盐水解酶负责胆盐的早期解离，但目前为止，它在胆盐胁迫应答中的作用机制还不清楚[51]。有研究表明，虽然胆盐水解酶的表达量并不受胆盐的调节，但是其在耐胆盐中也发挥了一些作用。相反，在体内试验中已经证实，在长双歧杆菌（B.longum）的细胞内积累的胆盐水解酶在兔子的胃肠道中存在，说明除胆盐外其它因子可能诱导了胆盐水解酶的表达[52]。

3 小结与展望

双歧杆菌的胁迫应答很复杂，包含一个错综复杂的应对各种环境胁迫的机制网络。双歧杆菌在食品中的应用很广泛，但是有关胁迫应答的分子机制研究却很少。近十年来，由功能基因组和蛋白质组数据支持的生理学分析，为我们提供了一些双歧杆菌应对环境胁迫的分子信息。这一领域在未来的研究中，必须充分利用细菌基因组项目和人类微生物组计划的大量数据，这将有利于理解双歧杆菌在人类宿主中的生存。另外，胁迫应答的研究中，通过建立应对不良环境的耐胁迫表型，产生良好的菌株性能，将使我们了解影响双歧杆菌性能的因素及如何合理的提高，同时也为益生菌的功能性研究提供了信息。

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