血脂异常ApoE 基因缺失小鼠视网膜及Bruch 膜组织形态观察
2013-04-13马玉兰曾庆华李罗翔
王 毅 马玉兰 巫 娟 曾庆华 李罗翔 李 娟
年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是黄斑区光感受器、视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)、Bruch 膜和脉络膜毛细血管的慢性进行性变性,随着年龄增长发病率增加,是发达国家导致不可逆视野缺损和失明的主要原因〔1〕。 世界卫生组织的研究报告表明,AMD致盲约占全球盲人的8.7%,全球约有3 000 万AMD患者,每年约有50 万人因AMD 致盲〔2〕。 在我国,由于人口老年化进程的加剧和饮食结构的变化, 其他致盲原因得到或加强了控制,AMD 日益成为重要致盲的眼病。 AMD 发病机理尚未明确,遗传因素和环境因素的共同作用是AMD 主要的发病原因〔3〕,血脂异常作为重要危险因素之一,越来越受到研究者关注,遗传学的研究证实AMD 的发生与载脂蛋白E(APOE)基因密切相关〔4〕。 ApoE-/-小鼠模型是研究动脉粥样硬化和神经系统退行性疾病的常用模型,我们前期实验通过观察血脂异常ApoE-/-小鼠视网膜外核层厚度、色素上皮细胞层厚度及Bruch 膜改变,发现血脂异常ApoE-/-小鼠视网膜和Bruch 膜的病理改变与AMD 病理改变一致〔5〕,为更好阐明血脂异常ApoE-/-小鼠模型可作为研究AMD 动物模型,我们进一步观察了血脂异常ApoE-/-小鼠模型视网膜外核层细胞、色素上皮细胞形态结构和细胞数目改变及Bruch 膜的组织形态改变,结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
实验用2 月龄的雄性普食C57BL 小鼠和以C57BL 为背景的ApoE-/-小鼠,分别由四川大学华西实验动物中心(动物合格证:川实动管质第09 号)和北京大学实验动物中心(美国Jackson 实验室引进)提供。普通饲料和高脂饲料均由成都达硕动物实验有限公司提供。 所有实验根据赫尔辛基宣言和保护及运用动物的指导原则来进行。
1.2 动物造模与分组
实验分为3 组,将24 只ApoE-/-小鼠根据体重分层随机分为:2 月龄ApoE-/-高脂组和2 月龄ApoE-/-普食组,每组12 只;另用12 只2 月龄C57BL普食组作为对照组。高脂组动物予高脂饲料,普食组动物予标准啮齿类动物饲料,饲料与水均自由摄取,所有动物在装有清洁过滤器的笼子中饲养,温度保持在22℃~25℃,相对湿度50%,保持12 小时,昼夜循环,共喂养至4 月~6 月龄。
1.3 观察指标及测试方法
1.3.1 血浆总胆固醇、低密度脂蛋白检测:禁食8 小时后,在动物宰杀前静脉注射镇静剂戊巴比妥钠,用肝素化的采血管采集股静脉血。使用日立7170 全自动生化分析仪检测血浆总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)。
1.3.2 视网膜光感受器细胞和Bruch 膜组织形态观察:摘出小鼠左眼,每组共12 只眼球,保留约1~2 mm 长视神经,用锋利的刀片在角巩缘处切一三角形小口,放入FAA(酒精-甲醛-醋酸)液中固定1周,切取含视神经的冠状面眼球壁组织3~5 mm 厚,逐级酒精脱水、石蜡包埋,切片4 um,行Masson 三色染色。 Masson 染色结果为:细胞核呈红色,光感受器细胞核呈鲜红色,Bruch 膜呈蓝绿色,纤维组织为绿色,脉络膜呈特有的黑色。 光镜下观察染色切片,首先在低倍视野下(100×)观察眼球壁各层组织结构,然后在中倍(200×)下观察视网膜光感受器细胞和色素上皮层细胞的形态结构,选择视盘两端视网膜、脉络膜各5 个视野,共计10 个视野,采用Mias2000 图像分析系统(四川川大智胜软件股份有限公司)半定量检测视网膜光感受器细胞核的面积;每个视野光感受器细胞核面积,表示光感受器细胞数;上述10个视野色素上皮细胞核的数目, 表示色素上皮细胞数;另外每幅图像10 次测量Bruch 膜厚度,取100次测量的平均值表示Bruch 膜厚度。 最后用高倍(400×)观察Bruch 膜结构和有无玻璃膜疣形成。
1.3.3 色素上皮细胞和Bruch 膜的超微结构观察:摘取小鼠右眼,每组取2 只眼球,经30ml/L 戊二醛预固定,10g/L 四氧化锇再固定, 丙酮逐级脱水,Epon812 包埋,半薄切片光学显微镜下定位,超薄切片,醋酸铀及枸酸铅双重染色,H-600Ⅳ型透射电镜观察。
1.4 统计学分析
采用SPSS 17.0 统计学软件进行统计分析。 本研究实验指标的数据资料以x±s 表示,3 个组小鼠血浆TC、LDL 浓度和光感受器细胞数、RPE 层细胞数及Bruch 膜厚度的差异均采用单因素方差分析,组间的多重比较采用LSD-t 检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组小鼠血浆TC、LDL 的比较
6 月龄ApoE-/-高脂组小鼠血浆TC、LDL 均显著高于6 月龄ApoE-/-普食组和6 月龄C57BL 普食组 (P<0.001),6 月龄ApoE-/-普食组小鼠血浆TC、LDL 显著高于6 月龄C57BL 普食组(P<0.001)(表1)。
表1 三组小鼠血浆TC、LDL 值(x±s,mmol/L)
2.2 三组小鼠视网膜光感受器细胞、RPE 及Bruch膜的组织形态改变
光镜下观察Masson 三色染色切片可见ApoE-/-高脂组小鼠视网膜变薄,光感受器细胞和RPE 细胞
均排列紊乱、稀疏和细胞萎缩,Bruch 膜变厚或粗细不均、胶原分叉,膜中聚集有大小、多少不等的红色无结构物质,即玻璃膜疣(图1-A);ApoE-/-普食组小鼠视网膜较薄,光感受器细胞和RPE 排列较紊乱、稀疏,细胞萎缩程度轻,Bruch 膜变厚或粗细不均、胶原分叉,但未见明显玻璃膜疣形成(图1-B);C57BL 普食组小鼠视网膜未见变薄,光感受器细胞和RPE 排列较整齐,未见明显细胞萎缩、稀疏,Bruch膜无变厚或粗细不均、无胶原分叉,未见玻璃膜疣出现(图1-C)。半定量检测结果显示光感受器细胞数:ApoE-/-高脂组比ApoE-/-普食组及C57BL 普食组明显减少,差异有统计学意义(P<0.01);RPE 数:ApoE-/-高脂组比C57BL 普食组明显减少 (P<0.001),比ApoE-/-普食组减少,差异无统计学意义(P>0.05);Bruch 膜厚度:ApoE-/-高脂组比ApoE-/-普食组及C57BL 普食组明显增厚(P<0.05,表2)。
2.3 视网膜RPE 和Bruch 膜超微结构改变
表2 三组小鼠光感受器细胞面积、RPE 数、Bruch 厚度值比较(x±s)
RPE:ApoE-/-高脂组色素上皮细胞基底膜皱褶变短且减少,胞质内线粒体肿胀,可见核边聚,胞浆中可见大量空泡(图2-A);ApoE-/-普食组色素上皮细胞基底膜皱褶减少,胞质内线粒体轻度肿胀,可见核边聚现象(图2-B);C57BL/6 普食组色素上皮细胞基底膜未见明显皱褶,胞质内线粒体结构基本正常(图2-C)。Bruch 膜:ApoE-/-高脂组Bruch 膜明显增厚,纤维结构明显减少,弹力层断裂,出现大量空泡(图2-A)。ApoE-/-普食组Bruch 膜纤维结构不均匀,弹力层断裂,有空泡出现(图2-B)。 C57BL/6普食组Bruch 膜纤维结构均匀,弹力层连续,未见明显空泡(图2-C)。
3 讨论
病理学研究发现AMD 的发生与异常脂肪代谢及转运相关〔6〕,Gaymer 研究证实高脂肪摄入与AMD发病风险增加有关〔7〕。 血脂异常可以导致视网膜色素上皮细胞的形态损害,Bruch 膜脂质的沉着破坏其完整性并导致脉络膜毛细血管内皮细胞的病理改变〔8〕。Fritsche 等研究发现ApoE 基因多态性与AMD之间存在显著相关性〔9〕,ApoE 是含有299 个氨基酸的磷脂糖蛋白,是组成脂蛋白的重要成分,其在调节脂质代谢、维持胆固醇平衡方面起重要作用。 ApoE基因及基因启动子具有多态性,启动子的突变显著降低ApoE 基因的表达并进而影响ApoE 蛋白的功能〔10〕,致ApoE-/-小鼠出现高脂血症〔11〕。
因此,我们采用高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠建立动物模型,结果发现,ApoE-/-普食组小鼠血浆总胆固醇和低密度脂蛋白比C57BL 普食组明显增高(P<0.001),高脂组ApoE-/-小鼠血浆总胆固醇和低密度脂蛋白比ApoE-/-小鼠普食组显著增高(P<0.001)。实验结果显示ApoE 基因缺失可引起脂质代谢障碍,导致小鼠高脂血症,结果与Debernardi 等报道一致〔11〕,经高脂喂养后血脂更高,这也与我们前期的研究结果一致〔12〕。
AMD 分为干性和湿性两种类型,干性AMD 以视网膜光感受器和RPE 改变为特征,表现为RPE及病变区的光感受器细胞萎缩,称为地图状萎缩,玻璃膜疣形成,Bruch 膜增厚或粗细不等。 湿性AMD在具有干性AMD 病理改变基础上,特征性的出现视网膜色素上皮下新生血管形成〔13,14〕。 我们通过高脂喂养ApoE-/-小鼠建立高脂血症动物模型后观察到,高脂组ApoE-/-小鼠视网膜光感受器细胞和色素上皮细胞排列紊乱、细胞萎缩,Bruch 膜变厚、粗细不等、胶原分叉,可见玻璃膜疣形成。 而作为对照组的C57BL 普食组小鼠视网膜光感受器细胞和色素上皮细胞、Bruch 膜均未见上述改变。 半定量检测视网膜光感受器细胞、色素上皮细胞数,结果显示高脂组ApoE-/-小鼠和普食组ApoE-/-小鼠视网膜光感受器细胞和色素上皮细胞数比普食组C57BL 小鼠明显减少(P<0.05-0.001),Bruch 膜厚度明显增厚(P<0.001)。超微结构观察进一步显示高脂组ApoE-/-小鼠RPE 和Bruch 膜出现明显损伤,表现为:RPE基底膜皱褶变短且减少,胞质内线粒体肿胀,可见核边聚,胞浆中可见大量空泡,Bruch 膜明显增厚,纤维结构明显减少,弹力层断裂,出现大量空泡。 而作为对照组的普食组C57BL 小鼠视网膜RPE 基底膜未见明显皱褶,胞质内线粒体结构基本正常,Bruch膜纤维结构均匀,弹力层连续,未见明显空泡。 上述改变显示高脂组ApoE-/-小鼠视网膜光感受器细胞、RPE 和Bruch 膜光镜和电镜下的组织形态改变符合AMD 的病理变化。
综上所述,高脂血症ApoE-/-小鼠视网膜光感受器细胞、色素上皮细胞及Bruch 膜发生了类似AMD的病理改变,可用该动物模型做AMD 的相关研究。
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