C型尿钠肽在动物繁殖过程中的作用研究进展

贾振伟 张家新 安磊 吴中红 田见晖

（1.内蒙古民族大学动物科技学院，通辽 028000；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；3.内蒙古农业大学动物科技学院，呼和浩特 010018）

C型尿钠肽（C-type natriuretic peptide，CNP）与心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）同属于尿钠肽家族成员，最初于1990年在猪的大脑中被分离提纯［1］，广泛分布于动物大脑、肾脏、心脏及血管等组织，具有维持心血管系统功能稳态、调控细胞增殖及促进骨骼生长等作用。值得注意的是，近年在小鼠中研究发现卵泡壁层颗粒细胞能够分泌CNP，通过结合卵丘颗粒细胞上的受体产生cGMP进入卵母细胞，从而维持高水平cAMP抑制卵母细胞减数分裂［2］。目前，家畜卵母细胞体外成熟后发育能力较差，为了促进胞质成熟、提高体外发育能力，国内外普遍采用减数分裂抑制剂处理卵母细胞，然后进行体外成熟、受精及胚胎培养，但是一般认为这些减数分裂抑制剂没有促进卵母细胞体外发育，甚至产生了不利的影响。CNP由22个氨基酸残基组成，是生理性多肽物质，相对于化学合成的减数分裂抑制剂危害性应较小，将可能替代传统的减数分裂抑制剂用于建立家畜卵母细胞体外成熟培养体系。此外，最近研究发现，CNP能够促进小鼠卵泡发育，而且增加了促性腺激素处理后的排卵数量［3］。基于以上发现，我们认为CNP在作为生理活性的减数分裂抑制剂促进家畜卵母细胞体外发育及超数排卵增强剂提高超排效率方面将具有潜在的利用价值。

1 C型尿钠肽结构

CNP是由22个氨基酸残基组成的多肽（CNP-22），其核心部分含有一个由17个氨基酸通过二硫键组成的环状结构，此结构环能够与受体结合，对维持CNP生物活性十分重要［4］。CNP是钠肽家族中最保守的成员，不仅物种间氨基酸序列高度一致，而且前体氨基酸序列也高度保守。例如，在牛、人、猪和小鼠中，成熟CNP氨基酸序列基本一致。人类的CNP前体（proCNP）含有103个氨基酸残基，细胞内蛋白酶furin可用于proCNP产生具有生物功能的由53个氨基酸组成的多肽（CNP-53）［5］。在某些组织中，CNP-53被一种未知的细胞外酶分解为CNP-22。体内成熟的CNP以CNP-53和CNP-22两种形成存在，其中CNP-22为循环的活性形式，而CNP-53为其储存形式，CNP主要以CNP-22形式发挥生物学作用［6］。

2 C型尿钠肽受体

目前，普遍认为哺乳动物钠尿肽家族有3种受体：NPR1、NPR2和NPR3（或NPRA、NPRB和NPRC）。NPR1、NPR2为鸟苷酸环化酶偶联受体（也称GC-A、GC-B受体），NPR-3为钠肽清除受体。钠尿肽主要通过NPR-1和NPR-2受体介导发挥生物学作用，激活偶联的鸟苷酸环化酶，使GTP转化为cGMP调控下游靶物质。研究认为CNP是目前已知唯一的NPR-2天然配体，其结合NPR2的能力比ANP大50倍，比BNP大500倍［7］。NPR3与3种钠肽结合能力基本一致。

NPR2蛋白细胞膜外结构与生长因子受体相似，大约由450氨基酸残基组成，主要起连接CNP的作用，跨膜区域为20-25氨基酸残基序列，细胞内结构由大约570个氨基酸残基组成。而且，细胞内结构由激酶同型区域（KHD）、卷曲螺旋状的二聚体及鸟苷酸环化酶催化区域组成。

3 C型尿钠肽作用机制

CNP与受体NPR2膜外蛋白区域结合后，使细胞内结构的KHD去磷酸化、构象发生变化，同时结合ATP激活鸟苷酸环化酶，将GTP转化为cGMP，然后激活下游信号通路。一般认为CNP引起细胞内反应依赖第二信使cGMP，目前研究证实cGMP能够结合3种蛋白激活下游生理反应，分别为cGMP依赖蛋白激酶G（PKG）、cGMP结合磷酸二酯酶（PDEs）、环核苷门控离子通道蛋白。

当前对CNP通过cGMP转导的信号通路研究比较清楚的是激活具有丝氨酸、苏氨酸激酶活性的PKG引起生物学反应［8］。PKG基因有PKGI、PKGII两种亚型。PKGI属于细胞内溶质，主要在血小板、平滑肌、心脏及大脑表达，研究表明同源重组敲除PKGI基因导致小鼠血管平滑肌松弛及幼龄小鼠血压升高［9］；PKGII主要位于细胞膜上，在肠、肾脏、软骨组织、大脑及骨骼表达较高，敲除PKGII基因导致小鼠和大鼠生长矮小［10］。磷酸二酯酶（PDEs）家族主要由11个成员组成，能够降解环核苷酸为5'核苷一磷酸，是环核苷酸的关键调控者。目前研究认为，cGMP能够引起PDEs构象发生变化，调控其活性。例如，cGMP结合PDE5后促进了cGMP的分解，PDEs构象变化也能激起cAMP和cGMP信号对话。例如，cGMP结合PDE2导致细胞内cAMP含量下降；相反，cGMP抑制PDE3活性，增加细胞内cAMP含量。

此外，cGMP也能通过调控环核苷门控离子通道蛋白介导细胞内反应。这些离子通道蛋白C端含有环核苷位点结合区域，能够结合cAMP或cGMP。但是，目前CNP与环核苷门控离子通道蛋白相关联的功能数据尚未见报道。

4 C型尿钠肽在动物繁殖过程中的作用

Sudoh 等［11］首先对猪大脑中的CNP进行了分离鉴别，随后研究确认其为神经递质及心血管肽，由此推测CNP可能参与动物繁殖机能调控。

4.1 C型尿钠肽在雄性动物繁殖过程中的作用

4.1.1 C型尿钠肽在雄性动物生殖器官上表达 Middendorff 等［12］研究发现，CNP和受体在人类睾丸中均有表达。El-Gehani 等［13］研究结果显示，CNP在胎儿期大鼠睾丸间质细胞内表达；近年研究发现大鼠出生时CNP表达量较多，然后逐渐下降，在出生后35 d表达再次增加［14］。小鼠出生后CNP表达模式与大鼠相似，出生时表达量较高，然后逐渐下降，在出生后20 d表达再次增加。Nielsen等［15］采用放射免疫方法检测了公猪多种组织的CNP蛋白表达量，发现CNP在附睾、生精囊泡和前列腺等生殖器官含量最高，并且mRNA在附睾、生精囊泡比其他组织高125倍。以上研究结果说明CNP在调控雄性动物繁殖过程方面可能具有重要作用。

4.1.2 C型尿钠肽在雄性动物繁殖过程中的调控 Chrisman等［16］研究发现CNP增加了猪精液的cGMP水平。由此推测CNP可能通过促进cGMP产生调控睾丸的内分泌功能。随后研究证明CNP能够促进睾丸间质细胞睾酮的分泌，同时也参与睾丸间质细胞和支持细胞功能的调控［17，18］。另外，CNP还可能以旁分泌的方式通过影响曲细精管的舒张来调控精子的传递和睾丸血液的供应。此外，普遍认为cGMP不仅能够调控睾丸的自分泌和旁分泌功能，同时也对阴茎勃起功能有影响。在兔子和大鼠中，CNP通过结合海绵体细胞膜上的NPR2受体，引起阴茎平滑肌肌肉细胞的松弛。Küthe等［19］发现，NPR2受体在人的阴茎海绵体组织中表达，说明CNP对阴茎勃起有作用。此外，体外培养期间，CNP促进了支持细胞表达雄激素结合蛋白、抑制素B和转铁蛋白，由于这些基因蛋白与血管屏障形成相关，揭示CNP可能参与了血管屏障的动态调控［14］。

4.2 C型尿钠肽在雌性动物繁殖过程中的作用

4.2.1 C型尿钠肽在雌性动物生殖器官上表达 Cameron等［20］利用mRNA原位杂交技术发现小鼠胎盘组织中CNP大量表达始于性交后10.5 d。Stepan等［21］检测到灰鼠胚盘组织内CNP mRNA在性交后9.5-15.5 d表达最高。大鼠胎盘CNP表达与ANP相似，在性交后16 d表达最高。胎盘、子宫以及卵巢组织间CNP表达的比较研究表明，胎盘CNP mRNA表达高于子宫和卵巢。另外，人类妊娠期胎盘组织的NPR1及NPR2表达变化幅度较大的研究结果进一步支持胎盘组织中钠肽系统功能性作用［22］。

Stepan等［23］发现，未妊娠小鼠子宫和卵巢组织CNP mRNA的表达最高，甚至超过了大脑和肾脏组织。更加细致的研究表明，子宫内CNP的表达受其他激素调控。例如，去势小鼠腹膜内注射雌激素以剂量依赖的方式促进子宫内CNP表达［24］。大鼠子宫中CNP表达受发情期影响，而且在发情初期表达最高。CNP的表达依赖发情周期归咎于子宫内容物及液体内容物质或者雌激素的变化［25］。同样，发情周期内大鼠卵巢组织中CNP和NPR2表达也呈时间依赖性的变化。此外，CNP/NPR2体系在卵巢组织中表达亦受激素调控，研究表明具有FSH功能作用的eCG注射小鼠后促进了 CNP/NPR2 mRNA表达，而具有LH功能作用的hCG抑制了其表达［26，27］。

4.2.2 C型钠肽在雌性动物繁殖过程中的调控 近年小鼠上的研究发现，CNP主要在卵泡壁层颗粒细胞表达，NPR2主要在卵丘颗粒细胞上表达，体外培养期间CNP抑制了卵母细胞减数分裂，敲除CNP基因后卵母细胞启动了减数分裂，说明CNP是体内在LH峰值启动前抑制卵母细胞减数分裂的功能性物质，其抑制减数分裂的机制是CNP作用于卵丘颗粒细胞后激活NPR2，产生大量的cGMP并进入卵母细胞，抑制PDE3A的活性，减少cAMP的分解，维持减数分裂的静止［2］。另外，McGee等［28］发现在卵泡窦前向窦内转变时期，8-bromo-cGMP（一种cGMP的类似物）可以降低卵泡闭锁，同时促进了有腔卵泡的发育。由此推测，CNP可能通过结合NPR2产生cGMP促进卵泡发育。最近研究结果显示，小鼠注射CNP后促进了卵巢上早期和后期有腔卵泡发育，使用eCG超排处理后增加了排出的卵母细胞数量，并且体外培养后没有影响卵母细胞发育能力［3］。一般认为FSH通过作用卵泡细胞G蛋白偶联的腺苷酸环化酶产生cAMP调控卵泡的生长发育，当前研究揭示CNP通过激活鸟苷酸环化酶产生cGMP也能促进卵泡发育，但是FSH和CNP通过第二信使cAMP/cGMP是否存在交叉作用通路调控卵泡发育尚不明确。

绵羊妊娠后期子宫内cGMP含量提高了38倍，说明激活了钠肽系统，促进子宫内cGMP的产生［29］。McNeill等［30］研究发现绵羊血液中母源CNP蛋白含量低，且稳定存在，但妊娠后40-50 d迅速增加，在妊娠120 d时达到高峰，在产前7 d迅速下降至妊娠前水平。小鼠子宫CNP mRNA浓度在妊娠期提高了7倍多，而卵巢中的水平则降低到未妊娠对照组的10%。以上数据揭示妊娠期间CNP可能通过松弛平滑肌肌肉抑制子宫收缩维持妊娠过程。CNP诱导的松弛可能不依赖cGMP介导的信号通路，因为抑制NPR1和NPR2活性并没有影响CNP对子宫肌层的作用［31］，具体的调控机制还有待进一步研究。

此外，羊妊娠期间子宫动静脉连接高浓度的CNP，揭示子宫胎盘组织是母源CNP的主要来源。但是，目前关于子宫和胎盘各自对母源CNP的贡献能力尚不明确。McNeill等［30］研究发现绵羊母源CNP含量与妊娠胎儿数量呈正相关，随后McNeill等［32］研究结果显示，在绵羊妊娠期间，胎盘组织是母源CNP含量的主要贡献者，合成的CNP与胎盘成熟和胎儿发育密切相关。然而，在人类研究结果显示，胎儿血浆CNP的含量高于母源水平，且母源与胎儿间梯度含量较低，表明母源和胎儿可能独立产生CNP。因此，在妊娠期间调控胎盘成熟和胎儿发育的CNP合成在物种间可能存在差异。

5 应用前景

目前，在畜牧业生产方面，雄性动物存在一些繁殖障碍问题，如阴茎勃起困难。由于CNP能够通过产生cGMP调控雄性动物阴茎勃起，将可能在治疗此项疾病方面发挥一定的作用，提高雄性动物的繁殖力。此外，也可以开发治疗男性因阳痿导致不育的药物。

鉴于CNP能够促进雌性动物卵泡发育，有提高排卵数量的作用，其可以在提高牛、羊等大家畜超排效率方面具有一定的利用价值。此外，目前由于家畜卵母细胞来源于卵巢上不同生长时期的卵泡，尽管体外成熟培养后能够完成减数分裂，但由于脱离卵泡内生理环境，体外难以获得支持受精后胚胎发育的胞质成熟，逐渐成为提高牛体外胚胎发育能力的瓶颈因素。另外，幼畜超排技术近年来有较大进展，但同样存在胞质不成熟导致胚胎发育能力低的问题。鉴于卵母细胞体内成熟过程涉及的生理条件及影响因素，许多学者理论上认为体外维持卵母细胞静止，模拟体内LH激素刺激启动GVBD前卵母细胞经历胞质成熟的历程，是提高受精后胚胎发育能力的一种重要的手段。但是，目前体外使用的减速分裂抑制剂没有显著的作用效果，一些物质甚至具有不利影响。值得注意的是，近年来一些学者研究发现CNP体外能够抑制卵母细胞减数分裂，且由于其为生理活性物质，用于体外成熟培养更接近于牛卵泡内的生理环境，对卵母细胞毒害应该小于化学合成的减数分裂抑制剂。因此，在体外用新型的减数分裂抑制剂提高卵母细胞发育能力方面将具有潜在利用价值。

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