GST-Smad4融合蛋白的表达与纯化

梅竹 杨予涛 徐志卿

（首都医科大学基础医学院，北京 100069）

转化生长因子-β（TGF-β），是一种具有多种生物学活性的多肽类细胞因子，由多种组织细胞合成，调控细胞周期，影响细胞的增殖、分化、黏附、转移和凋亡，与肿瘤的发生、发展和转归密切相关［13］。TGF-β信号通路主要由TGF-β与其相应的受体和细胞内信号转导分子组成。TGF-β信号通路的胞内转导分子主要由Smads蛋白构成。Smads蛋白主要由受体激活的Smads（R-Smad）、通用型Smads（Co-Smad）和抑制型Smads（I-Smad）构成。受体激活的Smads主要包括Smad2和Smad3，通用型Smads只包括Smad4，抑制型Smads包括Smad6和Smad7。

Smad4基因共有11个外显子，10个内含子，其转录子长2 680 bp，编码由552个氨基酸组成的蛋白质，主要由MH1结构域、MH2结构域和连接区所组成。MH1结构域具有序列特异的DNA结合能力，MH2结构域是形成同/异源聚合物的结合位，同时还具有转录激活和核定位功能［3］。Smad4作为一种抑癌基因，是TGF-β信号通路的重要调节因子，广泛参与细胞分化、增殖、迁移和凋亡等多种生物学过程［4］。

当细胞被TGF-β激活后，引起R-Smads（Smad2和Smad3）的磷酸化，而磷酸化的R-Smads从受体复合物上解离，迅速与Smad4形成异源复合物，然后被转运进细胞后，与Smad结合元件（SBE）结合，并在其它辅助因子的协同下，调节靶基因的表达［5］。因此，在TGF-β信号通路中，Smad4处于中枢地位。鉴于Smad4在TGF-β信号通路中处于的关键地位，本研究拟在体外表达并纯化Smad4蛋白，旨在分离和鉴定与Smad4相互作用的蛋白，从而进一步丰富TGF-β信号通路的组成。

1 材料与方法

1.1 材料

pGEX-4T-1质粒、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21（DE3）均为本实验室保存；高保真Taq聚合酶购于Roche公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购于MN公司；反转录试剂盒购于Invitrogen 公司；各种限制性内切酶购于NEB公司；Smad4抗体购于Milipore公司；MagneGST particles购于Promega公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖（IPTG）、考马斯亮蓝R-250购于北京普利莱公司；预染分子量标准蛋白marker购于Fermentas公司；引物合成与DNA测序由北京三博远志生物技术有限公司进行。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT细胞总RNA的提取 将长满培养瓶的HaCaT细胞用PBS洗两遍，加入1 mL的Trizol（Invitrogen），等细胞充分裂解后，将裂解液转移至无RNase的离心管中。加入0.2 mL的氯仿，震荡混匀，室温放置3 min。4℃，12 000×g离心10 min，将上层水相转移至无RNase的离心管中。加入0.5 mL的异丙醇，室温静置20 min。4℃，12 000×g离心10 min，并用75%的乙醇洗涤RNA沉淀，等沉淀干燥后，加入50 μL无RNase的水，用枪头洗打，使沉淀充分溶解。利用紫外分光光度计测定总RNA的浓度，用甲醛变性胶检测总RNA的质量。

1.2.2 HaCaT细胞总RNA的反转录 在一个无RN-ase的离心管中加入5 μg的总RNA，1 μL的OligodT，并用无RNase的水调节体积到12 μL。70℃水浴变性5 min后，将离心管迅速放置在冰上。加入4 μL的 5×reaction buffer，1 μL 的 RNase inhibitor，2 μL 10 mmol/L dNTP 和 1 μL 的 SuperScript®III Reverse Transcriptase，42℃水浴 60 min。加入 1 μL RNase H，37℃温浴10 min。将RT产物稀释到200 μL，-20℃保存。

1.2.3 质粒的构建 构建pGEX-4T-1-Smad4载体的上游引物5'-TACTCGGATCCATGGACAATATGTCTA TTACG-3'（下划线处为BamH I酶切位点），下游引物5'-ATCACGTCGACCAGTCTAAAGGTTGTGGGTCT-3'（下划线处为SalI酶切位点）。以HaCaT细胞的cDNA为模板，利用上述引物，进行PCR扩增。扩增条件为：94℃预变性2 min； 94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s；30个循环。将扩增到的PCR产物和pGEX-4T-1载体分别用SalI内切酶和BamH I内切酶进行双酶切，并将酶切后的PCR片段与剩余载体片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR验证阳性克隆，并将阳性克隆送往北京三博远志生物技术有限公司进行测序。

1.2.4 GST-Smad4融合蛋白的诱导表达 将构建成功的pGEX-4T-1-Smad4载体转化大肠杆菌BL21（DE3）表达菌中，37℃培养至OD600=0.6时，分别加入 1 mol/L的IPTG，至终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L。30℃诱导4-5 h，同时设未经IPTG诱导的菌液做对照。取1 mL诱导后的菌液，10 000 r/min 离心2 min，收集菌体，然后加入40 μL的1×SDS上样缓冲液，沸水煮5 min，然后10 000 r/min离心2 min，取上清用于SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色，检测GST-Smad4融合蛋白的表达情况。

1.2.5 GST-Smad4融合蛋白的纯化 收集1 mL诱导后的细菌，加入200 μL的裂解液，枪头混匀，室温摇动30 min。同时，在另一个离心管中加入20 μL的MagneGST particles，利用磁架，将上清吸去，再加入250 μL Binding/Washing buffer，悬浮磁粉，利用磁架，吸去上清，平衡磁粉。将平衡好的MagneGST particles加 入 100 μL 的 Binding/Washing buffer， 再加入100 μL的细菌裂解液，室温摇动30 min。利用磁架，吸去上清，加入250 μL的Binding/Washing buffer洗涤3次，吸取上清。用30 μL的0.1 mol/L谷胱甘肽洗脱融合蛋白，并在洗脱液中加入8 μL 的5×SDS上样缓冲液，沸水煮5 min，10 000 r/min 离心2 min，利用SDS-PAGE凝胶电泳检测融合蛋白的纯化效果。

1.2.6 GST-Smad4融合蛋白的鉴定 将纯化后GSTSmad4融合蛋白和HaCaT细胞总蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，电转至PVDF膜上。用5%的脱脂牛奶封闭2 h，按1∶1 000的比例加入Smad4单克隆抗体，孵育3 h后，洗去一抗，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，孵育40 min后，洗去二抗，再利用ECL显色发光试剂盒并结合胶片显影观察试验结果。

2 结果

2.1 Smad4基因的PCR扩增

提取HaCaT细胞总RNA，电泳检测RNA完整性良好，可用于反转录试验。以HaCaT细胞的cDNA为模板进行PCR扩增。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，观察到1 700 bp左右的扩增产物，与Smad4基因的预期大小一致（图1）。

图1 Smad4基因的PCR扩增结果

2.2 pGEX-4T-1-Smad4原核表达载体的构建

将扩增的Smad4基因片段和pGEX-4T-1载体分别用SalI内切酶和BamH I内切酶进行双酶切，电泳并回收酶切后的Smad4基因片段和pGEX-4T-1载体的大片段，通过T4 DNA连接酶将Smad4基因定向插入到pGEX-4T-1载体的多克隆位点中。将菌落PCR鉴定为阳性的2个重组子再进行酶切鉴定，2个重组子经酶切鉴定后均得到两条目的带，大约为1 700 bp和4 900 bp（图2），初步证明重组载体构建正确。将2个重组子进行测序。经过与GenBank的序列对比后，证明Smad4基因已经成功插入pGEX-4T-1载体，pGEX-4T-1-Smad4构建成功。

图2 重组质粒pGEX-4T-1-Smad4的鉴定

2.3 GST-Smad4融合蛋白的诱导表达及可溶性分析

将重组载体pGEX-4T-1-Smad4转化大肠杆菌BL21（DE3），收集细菌进行SDS-PAGE凝胶电泳，并用考马斯亮蓝染色。试验结果（图3）显示，5个GST-Smad4诱导组在80 kD处均出现明显条带，与预期结果相符，而未诱导的GST-Smad4表达菌在相应位置无蛋白条带出现，说明融合基因在大肠杆菌中得到有效的表达。但是，随着IPTG浓度的增高，融合蛋白的表达量并未增强。同时，将0.2 mmol/L的IPTG诱导下的GST-Smad4表达菌裂解，收集上清和沉淀，再利用SDS-PAGE凝胶电泳检测其可溶性。从图4中可以看出，GST-Smad4的融合蛋白主要在上清中表达，说明在30℃培养下，0.2 mmol/L IPTG诱导的GST-Smad4融合蛋白主要以可溶性的形式存在。

2.4 GST-Smad4融合蛋白的纯化

图3 不同浓度IPTG诱导下GST-Smad4 融合蛋白的表达分析

图4 0.2 mmol/L IPTG诱导下GST-Smad4 融合蛋白在上清和沉淀中的对比

将0.2 mmol/L IPTG诱导的GST-Smad4表达菌在-80℃放置1 h，将其融化，加入裂解液，超声破碎后，收集上清，加入MagneGST particles，通过结合、洗涤等步骤后，用0.1 mmol/L的谷胱甘肽洗脱GSTSmad4融合蛋白，并将纯化的GST-Smad4融合蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后考马斯亮蓝染色。如图5所示，GST-Smad4融合蛋白得到较好的纯化，纯度较高。

图5 GST-Smad4 融合蛋白的纯化

2.5 GST-Smad4融合蛋白的鉴定

分别将HaCaT细胞总蛋白和纯化的GST-Smad4融合蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，再将其转移到PVDF膜上，通过Western blot，检测融合蛋白能否被Smad4抗体特异识别。由于GST-Smad4蛋白比Smad4蛋白多了一个GST标签（约20 kD），其分子量预计在80 kd左右。如图6所示，GST-Smad4融合蛋白的条带出现在预期位置，说明Smad4的特异性抗体可以识别GST-Smad4融合蛋白，暗示GSTSmad4融合蛋白可用于后续的研究。

图6 GST-Smad4 融合蛋白的鉴定

3 讨论

Smad4是Smads基因家族的成员，最早被称为DCP4，位于人类染色体18q21.1上［6］。Smad4作为一种抑癌基因，主要通过与其它Smads蛋白的相互作用而参与TGF-β的信号转导。如果Smad4发生缺失或突变，则TGF-β信号转导网络就会被破坏，TGF-β信号途径在肿瘤发展中的抑制效应就会失［7］。

Smad4除了参与肿瘤的发生和发展外，还具有其它的生物学功能。研究发现，乙肝病毒编码的癌蛋白pX通过促进Smads蛋白的核转运和稳定Smad4蛋白的复合体而增强TGF-β信号通路，从而参与肝脏的纤维化［8］。同时，Smad4还参与睾丸、小脑、心瓣膜和早期胚胎的发育过程［9-12］。 因此，Smad4在生命过程中起到十分重要的调节作用。

鉴于Smad4在TGF-β信号途径中的中枢地位，发现和鉴定Smad4的共调节因子具有重要的意义。目前，已经发现了几个Smad4的共调节因子，如Bcl6，v-ErbA。Bcl6主要通过直接与Smad4的相互作用来抑制Smad4的转录活性，从而使B淋巴瘤细胞产生 TGF-β抗性［13］。v-ErbA通过与Smad4相互作用而干扰Smad4复合体向细胞核的转移，从而抑制了TGF-β信号通路的正常功能，进而使HD3B红白血病细胞产生TGF-β抗性［14］。因此，进一步的鉴定和发现Smad4的共调节因子对完善复杂的TGF-β信号网络具有重要的意义。

Biacore是一种基于表面等离子共振（SPR）的新型技术，利用该技术可以实时跟踪生物分子间的相互作用，分离与目的蛋白相互作用的蛋白，我们实验室拟利用这种技术分离与Smad4相互作用的蛋白。在Biacore试验中，获得Smad4蛋白是试验顺利进行的关键。为此，将Smad4基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1载体，通过IPTG诱导，得到带有GST标签的Smad4融合蛋白，再通过亲和层析纯化，得到了GST-Smad4融合蛋白，本研究为Biacore试验奠定了基础。

以往的研究发现，IPTG的浓度对外源蛋白的表达有着重要的影响，但是过高浓度的IPTG往往对细胞产生毒性，同时也影响蛋白的表达量和蛋白表达的形式。本试验探索了不同浓度的IPTG对GSTSmad4融合蛋白表达的影响。研究发现，随着IPTG浓度的增加，GST-Smad4融合蛋白表达几乎没有变化。因此，选择0.2 mmol/L为IPTG诱导的浓度。同时，分别检测了在0.2 mmol/L IPTG诱导下，GSTSmad4融合蛋白在BL2（DE3）表达菌裂解液的上清和沉淀的分布发现，低浓度的IPTG诱导下，GSTSmad4融合蛋白主要以可溶性的形式存在，主要分布在上清，而在沉淀中的分布很低。

4 结论

本研究成功构建了pGEX-4T-1-Smad4原核表达载体，摸索了GST-Smad4融合蛋白诱导表达的适宜条件，并获得了具有Smad4免疫活性的GST-Smad4融合蛋白。

［1］ Liu F, Pouponnot C, Massague J. Dual role of the Smad4/DPC4 tumor suppressor in TGFβ-inducible transcriptional complex［J］. Genes Dev, 1997, 11（23）：3157-3167.

［2］ Elliott RL, Blobe GC. Role of transforming growth factor β in human cancer［J］. Journal of Clinical Oncology, 2005, 23（9）：2078-2093.

［3］ Shi Y, Massagué J. Mechanisms of TGF-β signaling from cell membrane to the nucleus［J］. Cell, 2003, 113（6）：685-700.

［4］ Ikushima HK. Miyazono K. TGF-β singalling ：a complex web in cancer progression［J］. Nature Reviews Cancer, 2010, 10（6）：415-424.

［5］ Heldin CH, Landström M, Moustakas A. Mechanism of TGF-beta signaling to growth arrest, apoptosis, and epithelial-mesenchymal transition［J］. Curr Opin Cell Biol, 2009, 21（2）：166-176.

［6］ Lee DK, Park SH, Yi Y, et al. The hepatitis B virus encoded oncoprotein pX amplifies TGF-beta family signaling through direct interaction with Smad4：potential mechanism of hepatitis B virusinduced liver fibrosi［J］. Genes Dev, 2001, 15（4）：455-466.

［7］ Rozenblum E, Weinstein CL, Fischer A, et al. DPC4, a candidate tumor suppressor gene at human chromosome18q21.1［J］. Science,1996, 271（5247）：350-353.

［8］ Yang G, Yang X. Smad4-mediated TGF-β signaling in tumorigenesis［J］. Int J Biol Sci, 2010, 6（1）：1-8.

［9］ Hu J, Zhang YQ, Liu XP, et al. Expression and localization of Smad1, Smad2 and Smad4 proteins in rat testis during postnatal development［J］. Asian J Androl, 2003, 5（1）：51-55.

［10］ Fernandes M, Antoine M, Hébert JM. SMAD4 is essential for generating subtypes of neurons during cerebellar development［J］.Dev Biol, 2012, 365（1）：82-90.

［11］ Moskowitz IP, Wang J, Peterson MA, et al. Transcription factor genes Smad4 and Gata4 cooperatively regulate cardiac valve development［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108（10）：4006-4011.

［12］ Chu GC, Dunn NR, Anderson DC, et al. Differential requirements for Smad4 in TGFbeta-dependent patterning of the early mouse embryo［J］. Development, 2004, 131（15）：3501-3512.

［13］ Wang DG, Long JY, Dai FY, et al. BCL6 represses Smad signaling in transforming growth factor-beta resistance［J］. Cancer Res,2008, 68（3）：783-789.

［14］ Erickson RA, Liu X. Association of v-ErbA with Smad4 disrupts TGF-beta signaling［J］. Mol Biol Cell, 2009, 20（5）：1509-1519.