代谢组学研究进展及其应用

周秋香 余晓斌 涂国全 王强 胡文军 李汉广，

（1. 江西农业大学生物科学与工程学院，南昌 330045；2.江西农业大学附属医院，南昌 330045；3.江南大学生物工程学院，无锡 204122）

进入21世纪，人类赖以生存的环境、食品与能源等问题均面临着巨大的挑战。因此，人类想要继续生存必须走可持续发展道路，而生物技术在战胜这些挑战及环境友好型发展道路上发挥着至关重要的作用。代谢组学作为一种最新的组学技术之一，其在功能基因组学、植物、食品、疾病诊断及微生物等领域均有着广泛的应用。同时，代谢组学也是一门多学科交叉的技术，其与有机化学、分析化学、 化学计量学、信息科学及生物科学密切相关［1、2］。Fiehn等［3］在2000年以拟南芥叶为模型的工作标志着代谢组学已成为系统生物学的一个重要组成部分。

“代谢组学”一词来源于希腊语“meta”，意为改变或邻近的；而“nomos”，意为规则或规律［4］。代谢组学最初定义为：定量测量生命系统受病理生理刺激或遗传修饰后多种代谢反应［5］；而更为常见的定义则为：代谢组学（Metabolomics或Metabonomics）［6，7］是通过考察生物体系受到刺激或扰动前后（如将某个特定的基因变异或环境变化后）代谢产物图谱及其动态变化来研究生物体系的代谢网络的一种技术，研究对象主要是相对分子质量1 000以下的内源性小分子。

代谢组学与转录组学、蛋白质组学等其他组学的研究目标的最大区别是其研究代谢组的变化。所谓代谢组的变化是生物对环境、疾病，以及遗传变异等压力因素影响的最终应答［8］；与转录组学和蛋白质组学等其他组学相比，代谢组学具有以下优点［9］：（1）基因和蛋白表达的微小变化会通过代谢物得以体现与放大；（2）代谢组学的研究无需进行全基因组测序与建立大量表达序列标签（Expressed sequence tag，EST）的数据库；（3）代谢物的种类远少于基因和蛋白的数目；（4）通过对生物体液的代谢物分析可了解机体系统的生理或病理状态；（5）因需测定的代谢物在不同生物体中都是类似的，所以代谢组学采用的研究技术更为通用。通过代谢组学研究既可以发现生物体在受到各种内外环境扰动后的不同应答，也可以区分同种不同个体之间的表型差异。因此，代谢组学成为系统生物学研究的重要组成部分。

2 代谢组学研究技术

目前，代谢组学研究一般包括样品采集及预处理、数据采集及预处理、多变量数据分析、目标物识别和研究结果的解释与应用等步骤。代谢组学力求分析生物体系（如体液和细胞）中的所有代谢产物，所以整个过程中都强调尽可能多的保留和反映总的代谢产物的信息［10］。因此，进行代谢组学研究的主要挑战首先来自于如何满足对生物样品的高灵敏度、高通量、非破坏、无偏性的要求，并减少基质背景的干扰。

2.1 分析技术平台

与原有的各种组学技术中只分析特定类型的对象不同，代谢组学所分析的对象种类繁多，浓度范围分布广，性质差异大，要对它们进行无偏向的全面分析，单靠一种分离分析手段难以胜任。目前，在代谢组学中较为常见的分析手段有色谱、质谱、磁共振、紫外吸收、放射性检测、库仑分析及红外光谱等。由于没有一种分析手段能检测出所有种类的化合物，所以一个好的、现实的代谢组学分析手段应尽可能满足分析生物体系（如体液和细胞）中的所有代谢产物这一要求，应根据样品的性质及研究目的来选择并综合利用多种技术平台［11］。

迄今为止，在代谢组学研究技术中核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）是应用最早、最为常见的技术之一［12］，NMR是一种基于具有自旋性质的原子核在核外磁场作用下吸收射频辐射而产生能跃迁的谱学技术。目前常用的有氢谱（1H-NMR）、碳谱（13C-NMR）和磷谱（31P-NMR），其中以1HNMR应用得最为广泛［13］。

NMR技术对样品的需求量少、几乎不需要对样品进行前处理。此外，当采用漫射编辑（Diffusion-Editing）技术时，NMR方法还能提供丰富的分子信息，如代谢产物的结构、浓度、分子动力学及相互作用等。此外，由于NMR的非破坏性、非侵入性，特别是最近开发的魔角旋转（Magic angle spinning，MAS）磁共振、磁共振成像（Magnetic rresonance imaging，MRI）和 活 体 磁 共 波 谱（Vivo magnetic resonance spectrosocopy，MRS）等技术能够无创、整体、快速地获得机体某一指定活体部位的NMR谱［14］，是现有代谢组学分析技术中唯一能用于活体和原位研究的技术。

NMR技术最大的不足在于灵敏度低、分辨率不高，常常导致高丰度的分析物掩盖低丰度的分析物。但最近随着更高强度的磁场（900 MHz）、低温冷却探针和小容量微探针（60 μL）等技术的引入，其上述缺点自然很快成为历史［15，47］。

应用最广泛、最有效的代谢组学研究技术是气相色谱-质谱（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）［16，37］和液相色谱-质谱（Liquid Chromatography-Mass Spectrometr，LC-MS）［17］。前者适宜分析小分子、热稳定、易挥发、能气化的化合物；而后者能分析更高极性、更高相对分子质量及热稳定性差的化合物。而且，大多数情况下无需对非挥发性代谢物进行化学衍生化处理。因此这两种技术可以检测包括糖、糖醇、氨基酸、有机酸、脂肪酸和芳胺，以及大量次级代谢物在内的数百种化学性质不同的化合物。GC-MS具有较高的分辨率和灵敏度；有可利用的质谱数据库，易于使用且较为经济。特别是采用标准的电子轰击（Lectron Impact，EI）模式后，其使用范围与重复性都得到相应地提高，因此，与GC-MS相关技术的发展很快，如采用GCGC-MS技术通过增加单次分析可对普通一维色谱无法分离的复杂样品起到较好的分离效果［18］；利用二级气相色谱与飞行时间质（GC-GC-TOF-MS）联用可以进行高能量分析，其检测范围更广等［19］。但是，GC分离样品分子量范围有限，不能分离大分子物质，同时无法分析热不稳定性和不能气化的代谢产物。尽管衍生化预处理不仅费时而且过程会丢失某些物质的信号，但将样品衍生化后再进行GC分离，仍然是解决上述问题的一条有效途径。

2.2 后期数据分析

通过上述分析技术手段可产生海量的元数据（Metadata），需要借助于生物信息学平台进行数据的分析与解释。因此需要对元数据再经过一系列处理，才能通过多元数学统计分析和化学计量学理论对不同数据加以整合后从中有效挖掘出所需信息。在代谢组学研究中，通常是从获得的代谢产物信息中进行两类或多类的判别分类，一般采用无监督（Unsupervised）的主成分分析（Principal component analysis，PCA）［20］、非线性映射（Nonliner mapping，NLM）［21］、簇类分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）等［22］和有监督（Supervised）的偏最小二乘法-判别分析（Partial least squares-Discrimillant analysis，PLS-DA）［23］，人工神经元网络（Artificial neuronal network，ANN）［24］分析等数据分析方法。然而近年来支持向量机（Support vector machine，SVM）方法已逐渐应用于代谢组学后期数据的判别分析中［25］，其预测精度明显优于传统的PLS-DA方法。

3 代谢组学的应用

因为任何生理、病理及其他因素对生命系统的微小扰动都会引起生物体代谢物的浓度或代谢流发生变化，且大多数代谢途径不是孤立的存在，多重代谢物的变化是会发生。因此，测量单个或仅仅少数几个限定的代谢产物的价值非常有限，而代谢组学则是从整体上关注代谢产物的变化，因此代谢组学已成为一种成功的研究技术广泛应用于植物、分子表型、功能基因组学、药物毒性、药物疗效，分子病理学及疾病的诊断等领域。由于篇幅有限，本文仅对其在毒物学、疾病诊断、微生物及植物中的应用作简要介绍。

3.1 在毒物学研究中的应用

自20世纪80年代以来，NMR技术已广泛应用于毒理学的研究，并且在药物毒性与环境影响方面有大量的报道［26，27］。早期的工作主要是应用1HNMR技术分析哺乳动物的尿液与体液样本［28，29］。近年来，基于高分辨率的魔角旋转质谱（High rresolution magic angle sspinning，HRMAS）方法已发展成能够原位、活体及活体原位研究样本，由此为在分子水平及不同区间的组织病理学的结果提供可能［30］。因此，代谢组学技术在药物研发及临床用药阶段均发挥着重要作用，如进行早期动物活体毒性测试，为药物分子筛选提供理论依据，帮助确定药物的安全性生物标记物，研究临床用药的影响，由此可建立一些定量的、普遍的、整体的专家预测系统，为未来药物的发现和环境毒物学研究提供一种强有力的工具。

Kleno等［31］将蛋白质组学、基因组学与代谢组学结合起来研究肼类的肝脏毒性机制，并发现潜在的生物标记物。Schnackenberg等［32］通过研究一种广泛应用于治疗雌激素依赖性乳腺癌的药物-枸橼酸他莫昔芬时发现，此种药物在能提升大鼠血脂和血糖水平的同时，并且伴随着大鼠肝脏中甘氨酸和丝氨酸水平降低，尽管不能确定此种影响是否与其肝癌的发生有关。就目前而言，在疾病的治疗过程中药物的毒性也许不可避免，但代谢组学技术在早期发现药物的影响及其潜在的机制方面将会发挥着重要的作用。Sun等［24］通过进行儿茶酚氧位甲基移位酶抑制剂在大鼠体内代谢轮廓分析，为药物的药理、毒理研究提供依据。Ma等［33］应用代谢组学的方法分析大鼠尿液的变化来研究一种传统中药——牵牛花种子的毒性。结果表明，当用药后在大鼠尿液样本中12种代谢标志物发生了显著的改变，在大鼠肾脏发生严重损伤前的第2、6和10周代谢组学能清楚的区分模型组与对照组，而组织病理学只能到第10周后才能加以区分。

3.2 在疾病诊断中的应用

在多数情况下，临床病症状态是通过表型特征被认识，而病症的诊断则需要通过追踪和分析表型的发展而定。但对大多数疾病而言，疾病的形成有一个临床前的阶段，在此阶段扰动的生化物质经历由量变到质变的过程。当此物质累积到一定的程度疾病的症状便开始出现。但是当大多数疾病成为组织病理学可见的程度时，其已经对人体组织、器官造成不可逆的伤害。因此，在疾病发展阶段或初期一定有某些生化物质在蛋白质表达，特别是新陈代谢水平发生变化；如果能捕获这些早期由疾病引起的代谢产物，并对其进行分析，即代谢组学分析，定能更好地帮助了解疾病形成原因及物质在机体内的代谢途径，起到辅助临床诊断的目的［18、34］。

Wu等［35］基于饮食、环境、生活方式的小样本代谢组学研究，通过HPLC/MS技术，使得引起动脉粥样硬化状态的原因变得较为清楚，并且使如何防止和治疗动脉粥样硬化的方法变得更为集中。Shang等［36］总结了基于NMR技术在肿瘤学中的应用。Sabatine等［37］基于HPLC-MS/MS技术，通过代谢组学研究方法成功地进行心肌缺血的诊断，并且通过代谢物功能与变化趋势分析揭示出枸椽酸代谢途径异常在心肌缺血过程中所起的重要作用。Peng等［38］基于1H NMR技术并结合多元数据分析方法，研究家兔模型中动脉粥样硬化形成及相关的主动脉动脉粥样硬化斑块的生物标志物等代谢产物变化的起始及发展，结果表明，除了公认的传统风险因素外，确定了13个关键的动脉粥样硬化病变相关生物标志物。同时发现，磷酸胆碱和甜菜碱在家兔模型中可以作为一种潜在有价值的早期动脉硬化的预测因素。Li等［39］采用正交偏最小二乘判别分析法（Orthogonal partial least squares projection to latent structure-discriminant analysis，OPLS-DA）比 较 健康人与膝部骨关节炎（Knee osteoarthritis，OA）病人间组胺酸代谢物的变化，结果发现组胺酸新陈代谢混乱与膝关节炎息息相关，代谢组学可以作为一种全新的OA诊断方法。Liye等［40］采用基于NMR的代谢组学方法研究了多囊卵巢综合征患者（Polycystic ovary syndrome，PCOS）体内新陈代谢的变化，分析了PCOS患者与对照组新陈代谢的差异，这些显著的差异包括氨基酸代谢、肠道菌群、三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle，TCA）及脂肪酸代谢等，结果发现在PCOS患者体内当N-乙酰糖蛋白水平升高时有轻微的慢性炎症的存在。这项研究也证明了代谢组学是研究PCOS疾病的有效方法，由于代谢组学能够提供代谢产物及内在代谢途径变化的信息，因此代谢组学能够帮助人们了解疾病形成的原因及机制，代谢组学将会成为一种新的疾病诊断及治疗的方法。

3.3 在微生物领域中的应用

微生物广泛应用于发酵、环境修复及生物然料等领域；而通过微生物代谢组学分析其内在的代谢途径能够帮助人们更好地利用微生物在这些领域的应用。在微生物分类中，代谢谱分析方法（Metabolic profiling，MP）逐渐成为一种高通量、快速、全面的表型分类方法之一。采用代谢谱分析方法分类时，可以通过检测胞外代谢物来加以鉴别。一般胞外代谢物检测时需对其进行衍生化处理，然后进行薄层层析（Thin-Layer Chromatography，TLC）、GC-MS分析或HPLC-MS分析，最后通过特征峰比对进行分类［41］。Bundy等［42］采用NMR技术，分析代谢谱成功地区分开实验室来源以及临床病理来源的不同杆菌。

对发酵进行代谢调控需要检测大量的参数，利用代谢组学研究工具可以实现代谢物的高通量、高频率定量，并有助于揭示发酵过程的生化网络机制，从而有利于理性进行代谢控制发酵［43］。Dalluge等［44］利用LC-MS-MS方法对发酵过程中的氨基酸进行了监测，实现对整个发酵系统的快速监控；而接下来的研究将考虑缩小氨基酸监测范围，通过分析发现其中的一个子集可反映发酵的状态。

基因的功能往往通过转录和翻译过程得以体现，其最终的结果表现在生物的代谢水平及相关的最终代谢产物上。作为一个整体的代谢产物的测量方法，代谢组学是用来研究基因的功能及功能基因组学研究的首选工具。Raamsdonk等［45］通过在酵母中的共反应分析基因突变的酿酒酵母的代谢组学的变化来推断转入基因的功能。代谢组学有助于提高微生物的基因改造水平，提升转基因微生物在环境修复与生物然料等领域的应用效率。

3.4 在植物领域中的应用

代谢组学提供了一种基于代谢物水平无偏见的区分那些甚至会出现不明显表型的不同基因型。代谢组学的很多成就都集中在植物的细胞代谢组学这个相对独立的分支［46］。Hye等［47］分析了基于NMR技术在植物代谢组学中的应用。Humphreys等［48］研究表明，尽管论证所有必须酶在体外的活性，而导致木质素在体内形成的代谢途径的确切性质仍然是一个备受争议的问题。Fraser等［49］通过HPLC法分析表明，当番茄中表达细菌八氢番茄红素脱氢酶时，其体内β-胡萝卜素、叶黄素和循环类胡萝卜素的含量会增加。Atsushi等［50］回顾了利用植物代谢组学进行过量生产人体必需氨基酸之一的色氨酸的最新进展。

随着代谢组学分析技术及后期数据处理方法的进步，植物细胞代谢组学发展迅速，人们已经开始有意识利用这一技术成果。很多生物技术类公司都把代谢组学作为其主要的研究内容，他们的主要目标是通过代谢组学的研究了解当植物受到环境压力胁迫情况下其代谢途径与网络的变化及寻找植物代谢途径中的关键基因，如植物的抗旱、耐寒、耐盐咸等基因。然后利用基因工程等手段来改造植物的基因，同时利用代谢组学技术对基因改变前后的代谢产物进行分析，从而高效、迅速地把握相关植物代谢途径的信息，为提高植物细胞工厂效率、了解基因的功能及开展相关基础研究提供服务。

4 展望

代谢组学是系统生物学的重要组成部分，在最近的十几年研究中取得了长足的进步。国际性的代谢组学学会（metabolomicssociety.org）已经成立，该学会的目标是促进代谢组学的研究。在欧盟、美国、日本及其他许多国家的政府机构均为营养基因组学和代谢组学研究项目提供了大量财政资助，我国也在此领域开展了广泛研究［1］。随着人类基因组计划（Human genome project，HGP）的完成，代谢组学成为后基因组时代的研究热点，且发展迅速；在疾病诊断、植物、微生物及功能基因组研究等领域中发挥出日益重要的作用。未来主要发展方向包括发展更为广谱的、原位、即时、通用的检测方法，真正实现对生物样本内代谢物的无偏性、高通量、高灵敏度的分析，以及代谢组学数据与其他组学（如基因组学、转录组学、蛋白质组学等）数据的综合与整合。这将更有助于全面阐释各种细胞功能的分子基础。

另一方面，目前代谢组学的中心任务是侧重于寻找样本中相关特定组分的动态变化规律，并将其与对应的反应过程整合起来，使研究目标明确化。因此，如何尽可能多的获取样本中的特质是今后要解决的问题之一，代谢组学最终的目标是研究样本中每一代谢组分，通过代谢网络、神经网络等途径多角度、多层次、系统的研究隐藏在其中的内在规律，现在的检测技术及方法离这一目标还很远。总之，代谢组学研究存在着严峻的挑战。但相信随着科学技术的发展，综合利用以代谢组学、蛋白质组学及功能基因组学等为核心的系统生物学，将现代分析技术及方法进一步综合与整合，通过高效的数据处理手段及专家数据库的建立，代谢组学将在生命科学的诸多领域发挥重要作用。

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