几种DNA分子标记技术及其在茶树种质资源研究中的应用

晏嫦妤 李家贤 黄华林 吴华玲 乔小燕 何玉媚

（1.广东省农业科学院茶叶研究所，广州 510640；2.广东省茶树资源创新利用重点实验室，广州 510640；3.华南农业大学食品学院，广州 510642）

1974年，Grozdicker等［1］在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异，首创了DNA分子标记。所谓分子标记是指根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类遗传标记，它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。DNA分子标记以DNA为表现形式，消除了环境的影响，不存在基因表达与否和组织器官特异性，因此已被广泛应用于遗传图谱的构建、遗传育种、基因定位、物种亲缘关系等研究方面。本文综述了近年来出现的几种DNA分子标记——ACGM、SRAP、TRAP、SCAR、RSAP 及SCoT的原理、特点及其在茶树种质资源研究中的应用，并对其在茶树种质资源研究中的应用前景进行了分析。

1 几种分子标记的技术原理和特点

1.1 扩增共有序列遗传标记（Amplified consensus genetic markers，ACGM）

ACGM标记是Brunel等［2］于1999年依据模式植物拟南芥（Arabidopsis）与芸薹属（Brassica）物种间编码序列的保守性，首次提出的能够探知拟南芥和芸薹属间共有遗传信息的一种新型分子标记。ACGM是建立在亲缘关系较近的物种间同源基因中编码序列（外显子）存在高度保守性，而非编码区（内含子）存在潜在多态性基础之上的一种基于PCR 技术的分子标记。它以一种植物已知功能基因的保守编码序列为依据设计简并引物，而在另一种亲缘关系较近、需探知基因功能的植物总DNA中进行同源序列扩增，并通过分析扩增产物来进一步确定功能相同基因（直向同源基因）的存在与否、拷贝分布、拷贝数多少以及序列间同源性等。它最大的优点是探知新的功能基因而无需克隆，可以在很大程度上节省构建文库和人工诱变突变体的时间，具有简便、快捷的特点［3］。

1.2 相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）

SRAP标记是一种基于PCR的标记系统，是由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士［4］于2001年在芸薹属植物开发出来的。其原理是基于基因外显子GC含量丰富，运用CCGG序列可特异性扩增出包含这些组分的序列。而启动子和内含子AT含量丰富，可以与含有核心AATT序列的引物特异性结合。SRAP就是利用这一特点设计引物对基因开放阅读框架进行扩增。SRAP标记技术结合了RAPD和AFLP两者的优点，具有简便、稳定、高重复性、易测序等特点，并且应用少量的引物便可组配得到多对引物，提高了引物使用效率，降低了引物合成成本。但是由于SRAP标记是对开放读码框进行扩增的，因而对基因组相对较少的着丝粒附近以及端粒的扩增会较少，可能使得所构建的连锁图谱缩短或出现连锁群断开的现象。如果结合可扩增这些区域的SSR标记，便可获得覆盖整个基因组的连锁图，更好地运用于基因分离鉴定及调控研究等方面［5，6］。

1.3 靶位区域扩增多态性（target region amplified polymorphism，TRAP）

TRAP是一种基于PCR技术的分子标记，是由美国农业部北方作物科学实验室Hu与Vick［7］于2003年提出来的。TRAP技术是基于已知的cDNA或EST序列信息。目前已获得许多物种基因组序列的丰富信息，包括人类、拟南芥，以及重要作物水稻和多种微生物的基因组序列草图绘制成功，有大量的EST序列可供使用，从而使得可以利用生物信息学工具和EST数据库信息产生出许多靶基因序列的TRAP多态性标记，而且极易将性状与标记相关联。TRAP由SRAP技术改进而来，该技术使用长度为16-20核苷的固定引物（fixed primer）与随机引物（arbitrary prime），固定引物以GenBank中的靶EST序列设计而来；另一个为随机引物，针对外显子或内含子的特点，分别设计为富含GC或AT核心区的任意序列。通过对目标区域PCR的扩增，产生围绕目标候选基因序列的多态性标记［8］。TRAP标记具有操作简单、重复性高、稳定性好、效率高等特点。而且，由于TRAP技术是基于已知的cDNA或EST序列信息，极易将庞大的EST序列信息和植物重要农艺性状相联系，在种质资源基因鉴定和作物理想农艺性状基因标记上很有帮助。

1.4 序列特定扩增区域标记（sequence characterized ampli fied region，SCAR）

SCAR标 记 是Paran和Mihcelmore［9］建 立 的一种可靠、稳定、可长期利用的标记技术，是在RAPD标记基础上发展起来的。先用随机引物对基因组DNA进行RAPD扩增，筛选特异片段，获取特异的RAPD标记，进行克隆和测序，然后根据测序结果设计引物，对基因组DNA进行PCR特异扩增，这样便将与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。SCAR标记技术对比RAPD技术有以下优越性：（1）由于使用较长的特异性引物和较高的退火温度，可有效解决RAPD标记结果不稳定、重复性差等问题；（2）可将显性的RAPD标记转化为共显性的SCAR标记，解决由于DNA降解对RAPD带来的影响；（3）获得的条带单一，克服了RAPD标记的不稳定和统计不便等缺点。因此，SCAR标记技术已成为转化RAPD标记的一种稳定可行的方法［10-12］。

1.5 限制性位点扩增多态性（restriction site amplification polymorphism，RSAP）

RSAP为杜晓华等［13］建立的一种检测基因组上广泛分布的限制性酶切位点多态性的DNA分子标记系统。它的原理是采用2条长度均为18 bp的引物，引物的5'端为12-14个碱基的随机序列，接着是4-6个碱基的限制性酶切位点序列，2条引物采用不同的限制性位点和随机序列，PCR扩增程序借鉴了SRAP技术，前5个循环采用较低的退火温度以保证扩增效率，随后35个循环采用较严谨的退火温度对已扩片段特异性扩增，以保证扩增产物的稳定。扩增产物从6%变性聚丙烯酰胺凝胶中分离，银染显色。RSAP标记有以下优点：（1）无需酶切，仅用一个简单的PCR反应即可实现对DNA限制性位点多态性进行检测，比以往基于限制性位点的标记技术操作更加简便；（2）引物可以两两随机配对，加上步骤较少，一定程度上降低了成本；（3）扩增的限制性位点散布于整个基因组区；（4）具有中等产率、稳定可靠的特点和较广泛的适用性。

1.6 起始密码子多态性（start codon targeted polymorphism，SCoT）

SCoT分子标记技术是一种目标分子标记技术，是由Collard和Mackill［14］在水稻研究中提出的，其依据植物基因中的ATG 翻译起始位点侧翼序列的保守性，设计单引物并对基因组进行扩增，扩增产物用简单的琼脂糖分离检测。引物设计是SCoT标记的核心。一系列研究表明，基因的起始密码子的附近序列非常保守，具有一致性。SCoT标记的引物就是根据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼区域的保守性来设计的。在SCoT标记中的单引物与RAPD、ISSR单引物的作用几乎相同，同时充当上下游引物，不同的是SCoT单引物可同时结合在双链DNA的正负链上的ATG翻译起始位点区域，从而扩增出两结合位点之间的序列。SCoT分子标记作为一种新型分子标记有几大特点：（1）建立在PCR基础上的单引物扩增，操作简单，易于各种物种SCoT标记技术体系的建立；（2）和ISSR标记相比，它是一种目的基因分子标记，能有效产生和性状连锁的标记，方便分子标记辅助育种；（3）使用了较长的引物长度，理论上比RAPD标记重复性好；（4）引物设计简单，可在原有引物序列基础上做少许改动来设计更多新引物，设计好的SCoT标记引物可以在物种间通用。

2 几种分子标记在茶树种质资源研究中的应用

分子标记对于研究茶树的遗传多样性和鉴定优质品种资源具有重要作用。多种分子标记如RFLP、RAPD和AFLP等已经应用于茶树种质鉴别，遗传多样性分析，遗传稳定性和遗传作图等领域。目前，上述新型分子标记技术在植物分类学［15］、遗传多样性［16］、遗传图谱构建［17］和辅助育种［18］等方面的研究广为应用，但在茶树种质资源方面的研究应用较少，主要集中在遗传多样性及特异标记方面。

沈程文等［19］采用表型鉴定与SRAP分子标记，对25份广东茶树种质和5份对照品种的遗传多样性进行系统评价和分类，表明21对SRAP引物共扩增出127条带，其中114条为多态性带，占88.67%；平均每个引物组合的谱带数和多态性带数分别为6.05条和5.43条，当遗传距离为0.39 cm时，茶树种质可分成A、B、C 3类，其中A类占83.33%；当遗传距离为0.31 cm时，又可将A群划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个亚群，其中第Ⅰ亚群包括13个品种，第Ⅱ亚群包括2个品种，第Ⅲ亚群包括10个品种。该研究证实了SRAP分子标记在检测茶树种质资源多态性方面具有较高的效率，并且该分子标记是针对开放阅读框进行扩增，增加了扩增结果与表型性状的相关性。

唐玉海［20］利用TRAP技术对16个茶树品种进行研究，从35对TRAP引物组合中，选用了18对多态性较好的组合，总共产生了72条条带，其中多态性条带56条，占总条带的77.78%，条带大小大约在100-800 bp，平均每个引物扩增4条，多态性最高为100%，最低为33%。说明该标记能有效地应用与茶树种质资源遗传多样性的分析。唐玉海等［20］还通过与抗旱相关的几个基因设计引物，对扩增出的条带进行聚类分析显示，叶型较大，明显不抗旱的云南大叶和优10单独聚为一类，而其余几个叶型较小，抗旱性较好的品种聚为一类，初步揭示了种质的抗旱性差异。该项研究说明了TRAP分子标记能有效地将茶树的有关性状和分子标记关联起来，在茶树种质资源鉴定研究中具有较好的前景。

丁 洲 等［21，22］开 展 了 茶 树 的RAPD标 记 向SCAR标记转化的研究。结果表明，用SCAR引物扩增的DNA条带清晰明显，与RAPD相比，其对反应条件的敏感程度低。因此，特异性和重复性较好，是一种可以直接指导茶树生产实践的种质鉴定方法，解决了RAPD标记的不稳定性和AFLP标记的繁琐、高成本的问题，这也进一步证实了SCAR标记的优越性。

刘循等［23］以局部发生的黑刺粉虱Aleurocanthus spiniferus（Quaintance）为对象，利用SCAR标记技术获得了长度为987 bp的黑刺粉虱特异性片段（GenBank登录号为FJ613323），根据此片段的碱基序列设计黑刺粉虱特异性引物1对（AS-F518/ASR938）。该研究以SCAR标记技术成功地将黑刺粉虱与其他种类的粉虱如桔绿粉虱、烟粉虱（B型、Q型、ZHJ-1型和ZHJ-2型）、温室粉虱、螺旋粉虱等进行了有效区分，体现了其特异性。通过该项研究说明，SCAR分子标记技术有望在茶树苗木调运的害虫检疫和监测/检测中得到实际应用。

3 几种分子标记在茶树遗传育种中的应用前景分析

对于应用分子标记辅助育种的关键是要找到一些与性状相关联的标记，而TRAP标记是基于已知的cDNA或EST序列信息，极易将EST序列信息和植物重要农艺性状相联系。到2012 年6月12日为止，在GenBank的dbEST数据库中登录的茶树ESTs已有28 794条，因此将TRAP技术应用在茶树育种上找到一些与茶树优良性状相关的标记，对加快茶树优良性状的鉴定及品种选育具有重要意义。

随着功能基因组学研究的深入和生物信息学的发展，目的基因分子标记和功能性分子标记越来越来受到研究者的重视，因其本身可能是目的基因的一部分或与目的基因紧密联锁，这样通过对某个分子标记的筛选即能对性状进行筛选，从而加速育种进程［24］。近几年，目的基因分子标记类型被广泛开发并应用。SCoT标记技术是一种除SRAP、TRAP等标记外一种能跟踪性状的新分子标记技术，该技术已被成功应用于水稻［25］、花生［26］和龙眼［27］中。植物间基因功能的保守性决定了基因序列的保守性，利用功能基因保守序列开发出来的SCoT 标记可转移性更强。来自单子叶植物（水稻）的SCoT 标记引物，在双子叶植物花生中的扩增效果也很好，说明SCoT 标记可在不同物种间共用。因此，该技术有望在茶树育种中得到应用，推动茶树功能型分子标记的研究开发。

4 小结

各种DNA分子标记技术从诞生到发展至今都有其自身的优缺点，在各自特定的领域中均具有不可替代的作用，虽然目前这些分子标记在茶树种质资源研究中应用较少，但随着茶树分子生物学数据及资源的不断增多加之生物信息学、基因芯片等新技术的不断发展及其与分子标记技术的相互融合和相互渗透，DNA分子标记技术将在茶树种质资源研究领域有更广泛的用途和前景。如ACGM标记，能够探知亲缘关系较近的物种间的同源基因的功能，对于茶树这种遗传背景复杂，且基因序列研究较少的物种，可以通过一些和茶树亲缘关系较近且功能基因研究较多的物种进行ACGM标记，找到一些新的功能基因。

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