益肾活血平喘合剂对哮喘大鼠气道TGF表达的影响

张元元，张燕萍，王书臣，林加杨，樊茂蓉

（1.中国中医科学院西苑医院，北京100091；2.大理学院附属医院，云南大理671000）

张元元1，2，张燕萍1，王书臣1，林加杨1，樊茂蓉1

（1.中国中医科学院西苑医院，北京100091；2.大理学院附属医院，云南大理671000）

目的：探讨益肾活血平喘合剂对哮喘大鼠气道TGF β1表达的影响。方法：健康雌性SD大鼠60只。随机分为4组，即正常组、模型组、地塞米松阳性对照组、益肾活血平喘合剂组，每组15只大鼠。除正常组外，其余3组均利用哮喘模型。各组于造模后14 d开始每天给药及雾化吸入。造模后28 d处死动物，取同一部位肺叶，包埋，切片，HE染色及免疫组化检测气道TGF β1的表达。结果：益肾活血平喘合剂组气道TGF β1的表达明显少于模型组（P<0.01）及阳性对照组（P<0.05）。结论：益肾活血平喘合剂通过抑制气道TGF β1的表达，减轻哮喘气道炎症及重塑的发生。

益肾活血平喘合剂；哮喘；TGF β1

支气管哮喘在病理学上的主要改变是气道炎症和气道形态学上的变化（即气道重塑）。气道炎症和气道重塑互为因果，最终使肺功能发生进行性损害〔1〕。转化生长因子β（TGF β1）是哮喘气道炎症和气道重塑过程中重要的信号传递调控因子。嗜酸性粒细胞、气道上皮、巨噬细胞及纤维母细胞是气道中TGF β1的主要来源。TGF β1在哮喘气道炎症和纤维化过程中发挥着重要的作用，比如促进炎性细胞及纤维母细胞的产生及趋化，致使炎症反应发生；刺激胶原物质及细胞外基质等物质的合成和分泌，导致气道纤维化；破坏基质金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制因子的平衡，致使基质沉积，气道管腔变窄；使肌成纤维细胞增多，促进胶原的合成和血管的生成，导致气道壁增厚〔2〕。益肾活血平喘合剂是我们在临床上治疗哮喘反复发作、迁延不愈一种较好的方药，但具体机制尚不清楚。本研究通过免疫组化的方法观察益肾活血平喘合剂对哮喘大鼠气道TGF β1的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与分组健康雌性SD大鼠60只，体重（200±10）g。购自北京市通利试验动物养殖场（许可证编号：SOXK（京）2002-0203）。随机分为4组，即正常组、模型组、地塞米松阳性对照组、益肾活血平喘合剂组。

1.2 药物与试剂益肾活血平喘合剂由补骨脂、生地、赤芍、川芎、炙麻黄、杏仁、茯苓、穿山龙、炙甘草等药物组成，含生药量4 g/mL，北京西苑医院制剂室制备（批号：20050321）；地塞米松针剂（济南利民制药有限责任公司）；卵白蛋白（OVA）购自Sigma公司；氢氧化铝购自北京化学试剂公司；灭活百日咳菌苗购自北京生物制品所；免疫组化染色试剂盒购自ZYMED公司；抗TGF β1抗体购自Santa Cruz生物公司；3.5%水合氯醛购自北京西苑医院制剂室。

1.3 主要仪器和设备医用雾化器（402型）（上海合力医疗器械厂）；台式离心机（80-2）（上海医疗器械厂）；石蜡切片机和图像分析系统（LEICAQ550CW）（德国LEICA公司）。

1.4 造模与给药参照文献〔3-4〕方法，每只造模大鼠腹腔注入1 mL含100 mg OVA、100 mg氢氧化铝、5×109灭活百日咳菌苗的生理盐水混悬液（定义为第1 d），14 d后将动物置于密闭喷雾箱，给予1%的OVA生理盐水超声雾化吸入，直至大鼠出现呼吸急促、喘息症状明显的哮喘样发作，每次约20 min，共持续14 d。正常组用同样操作以生理盐水处理动物。给药：每天雾化前30 min，正常组及模型组用生理盐水灌胃；地塞米松阳性对照组腹腔注射地塞米松，剂量为0.5 mg/kg；益肾活血平喘合剂组给予益肾活血平喘合剂灌胃0.45 g生药/100 g。

1.5 肺组织病理学第28 d，末次激发结束后5～8小时内，处死大鼠，取大鼠右肺下叶同一部位标本，于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察大鼠肺组织病理学变化。

1.6 大鼠气道TGF β1的表达采用免疫组化ABC法，按抗TGFβ1抗体即用型免疫组化试剂盒提供方法操作，光镜下观察气道TGF β1的变化，并用LEICA-Q550CW图像分析系统测定气道TGF β1的相对含量。每组取来自3只大鼠的3张切片，每张切片随机取3个视野进行图像分析，分别测定平均光密度值（OD值）。

1.7 统计方法采用SPSS10.0统计软件进行数据处理。组间比较采用单因素方差分析，统计结果以±SD表示。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理学变化HE染色显示：正常组气道壁薄，气管黏膜结构完整，肺泡隔窄，气道平滑肌薄，未见明显炎性细胞浸润，肺泡腔透亮，无炎性物质渗出。模型组气道壁明显增厚，气道黏膜皱襞增多，肺泡隔增厚，气道平滑肌的厚度明显增加，肺泡间质、黏膜下及管壁均有大量淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润，气道腔狭窄，气道腔内充填大量液体物质。阳性对照组气道壁增厚皱襞增多，但较模型组轻，肺泡隔及气道平滑肌的厚度与模型组相似，支气管及肺泡炎性细胞浸润轻于模型组。益肾活血平喘合剂组气道壁及皱襞轻微增厚，肺泡隔及气道平滑肌的厚度比阳性对照组薄，炎性细胞浸润与阳性对照组相似。见图1。

图1 HE染色显示不同实验组气道形态变化

2.2 免疫组化测定各组大鼠气道TGF β1表达的变化模型组反应最强，呈深棕色；地塞米松阳性对照组、益肾活血平喘合剂组阳性稍弱，渐呈棕黄色至浅黄色；正常组阳性进一步减弱，呈淡浅黄色，见图2。每组取来自3只大鼠的3张切片，每张切片随机取3个视野进行图像分析。所得数据进行统计学分析，结果如下：模型组（0.50±0.036）与正常组（0.41±0.024）比有差异有统计学意义（P=0.000）；地塞米松阳性对照组（0.45±0.034）与模型组比差异有统计学意义（P= 0.015）；益肾活血平喘合剂组（0.41±0.054）与模型组比差异有统计学意义（P=0.001）；益肾活血平喘合剂组与地塞米松阳性对照组比差异有统计学意义（P= 0.035）。见图3。

图2 免疫组化显示不同实验组TGFβ1的表达

图3 大鼠气道上皮TGF β1表达的OD值

3 讨论

我们用卵蛋白等试剂连续致敏大鼠后，大鼠喘息症状明显；形态学观察发现在肺泡间质及管壁黏膜下出现了大量嗜酸性粒细胞〔5〕、淋巴细胞浸润、气道壁增厚、平滑肌肥大、管腔狭窄。与文献〔3-4〕报道基本一致，说明模型构建是成功的。嗜酸性粒细胞可以产生大量的TGF β1，而TGF β1是哮喘气道炎症和重建的重要调控因子，可以促进气道纤维化及抗炎细胞因子产生〔2，6〕。我们的研究结果显示：模型组中，TGF β1在间质细胞、肺泡巨噬细胞及气道黏膜上皮组织呈深棕色，呈强阳性反应。

中医学将支气管哮喘归属于“哮病”的范畴。我们认为哮喘反复发作为本虚标实，下虚上实之症，以阳虚为本，痰瘀为标。肾虚乃哮喘发病之根。痰瘀互结则构成支气管哮喘的重要病机。在临床上运用益肾活血平喘合剂治疗哮喘反复发作、迁延不愈的患者，取得较好的疗效。方中补骨脂辛、温，归属肾经，温肾壮阳；生地苦、甘、寒，滋阴，二者共为君药。川芎辛、温，行气活血；赤芍苦、微寒，活血凉血，与川芎协同作用，加强活血散瘀之功；炙麻黄，辛苦而温，宣通肺气，降逆平喘；杏仁苦、温，善于除痰下气，降利肺气而平喘咳，与麻黄相配则宣降相因；穿山龙，通络活血，化痰清肺；茯苓，化痰健脾，二者共为臣药。炙甘草，补脾益气化痰，作为佐使，调和诸药。诸药合用，益肾活血，宣肺平喘，健脾化痰。本研究证实益肾活血平喘方药组大鼠气道炎症改变明显轻于模型组；其气道TGF β1的表达明显低于模型组（P<0.01）及阳性对照组（P<0.05），而TGF β1是哮喘气道炎症和重建的主要调控因子〔7〕，因此我们推测益肾活血平喘方药可能通过抑制TGF β1的表达，从而减弱炎症反应及减少胶原的产生，防止气道重塑的发生，为我们进一步运用益肾活血平喘方药治疗哮喘提供了理论依据。

〔1〕Beckett P A，Howarth P H.Pharmacotherapy and airway remodelling in asthma〔J〕.Thorax，2003，58（2）：163-174.

〔2〕Hashimoto S，Gon Y，Takeshita I，et al.Transforming growth factor-β induces phenotypic modulation of human lung fibroblasts to myofibroblast through a c-jun-NH2-terminal kinase-dependent pathway〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2001，163（1）：152-157.

〔3〕施新献.现代医学实验动物学〔M〕.北京：人民军医出版社，2000.

〔4〕Karol MH.Animal models of occupational asthma〔J〕.Eur Respir J，1994，7（3）：555.

〔5〕Mu oz X，Sanchez-Vidaurre S，Roca O，et al.Bronchial inflammation and hyperresponsiveness in well controlled asthma〔J〕.Clin Exp Allergy，2012，42（9）：1321-1328.

〔6〕Tatler AL，Jenkins G.TGF-β activation and lung fibrosis〔J〕.Proc Am Thorac Soc，2012，9（3）：130-136.

〔7〕Todorova L，Bjermer L，Westergren-Thorsson G，et al. TGF β1-induced matrix production by bronchial fibroblasts in asthma：budesonide and formoterol effects〔J〕.Respir Med，2011，105（9）：1296-1307.

（责任编辑 李杨）

Effects of YiShenHuoXue Decoction on TGF β1Expression in Asthma Rats

ZHANG Yuanyuan1,2,ZHANG Yanping1,WANG Shucheng1,LING Jiayang1,FANG Maorong1
（1.Xi Yuan Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100091,China; 2.Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the effects of Yishenhuoxuepingchuan（YSHXPC）decoction on TGF β1expression in airway of asthma rats.Methods:Sixty health female SD rats were randomly divided into 4 groups（15 in each）:the normal group（normal rats+saline）,the model group（athema rats+saline）,the positive control group（athema rats+hexadecadrol）,and the YSHXPC decoction treatment group（athema rats+YSHXPV decoction）.Each group was delivered aerosol inhalation of drug every day since the 14th day.Rats were sacrificed in the 28th day,pathological changes of lung observed by HE staining and TGF β1expression in lung tissue by immunohistochemical stain were conducted.Results:The results showed that the TGF β1expression was higher in normal group compared with other three groups.In YSHXPC decoction group,the TGF β1expression was reduced significantly compared with the model group and the positive control group.Conclusion:This research showed that YSHXPC decoction can effectively inhibit the TGF β1expression in experimental rats with asthma.

Yishenhuoxuepingchuan（YSHXPC）decoction;asthma;TGF β1

R256.12

A

1672-2345（2013）06-0031-03

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.06.009

2012-09-27

2012-11-16

张元元，高级讲师，主要从事临床医学教学研究.