HPLC法测定川滇桤木中绿原酸的含量

尹腊梅，杨晓珍，曹艳花，刘婷，肖培云

（大理学院药学与化学学院，云南大理671000）

HPLC法测定川滇桤木中绿原酸的含量

尹腊梅，杨晓珍，曹艳花，刘婷，肖培云*

（大理学院药学与化学学院，云南大理671000）

目的：建立HPLC法测定川滇桤木中绿原酸的含量。方法：采用高效液相色谱法，Venusil X BP-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液（8∶92），流速为1.0 mL/min，检测波长为324 nm，柱温25℃。结果：绿原酸在0.108 8 μg~ 1.088 μg范围内线性关系良好，r=0.999 9，平均加样回收率为98.98%，RSD=0.77%（n=6）。结论：本法操作简便、快速、稳定性高、重现性好，可用于川滇桤木中绿原酸含量的测定。

川滇桤木；绿原酸；高效液相色谱

川滇桤木（Alnus ferdinandi-coburgii）为桦木科桤木属植物，为中国特有植物。分布于中国大陆的贵州、四川、云南等地，在民间被广泛用于治疗鼻衄，肠炎，痢疾等症。有研究显示，桤木属植物主要含有二芳基庚烷类化合物〔1〕和齐墩果酸、喜树碱、绿原酸〔2〕等化学成分，并具有抗氧化活性和抗肿瘤成分〔3-4〕。现代研究表明：绿原酸对急性咽喉炎症和化脓性皮肤疾病疗效显著，具有抗菌、利胆、抗病毒、增加白血球、止血以及兴奋中枢神经系统等多种药理作用〔5-7〕，有着独特的医疗、保健功能。本实验研究采用高效液相色谱法测定桤木各部位中绿原酸的含量，为桤木资源的开发利用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器Agilent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司，包括G1315A/BDAD检测器，G1313A ALS自动进样器，Agilent 1100色谱工作站）；SB2200超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；AE240电子天平（瑞士梅特勒）；KL-UPUV-20超纯水仪（成都唐氏康宁科技发展有限公司）。

1.2 试药桤木（采自大理苍山，由大理学院生药学教研室杨月娥老师鉴定）；绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110753-200413）；高效液相用甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Venusil XBP-C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（8∶92）；检测波长：324 nm，流速：1.0 mL/min，柱温：25℃；进样量：10 μL。对照品及样品色谱图见图1。

图1 对照品（A）及样品（B）HPLC色谱图（1-为绿原酸）

2.2 对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品5.44 mg于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.544 0 mg/mL的储备液。精密移取储备液1 mL于5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得浓度为0.108 8 mg/mL的绿原酸对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备精密称取桤木药材粉末1 g，置100 mL具塞圆底烧瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，密塞，称重，超声处理30 min，用60%甲醇补足减失重量，用0.45 μm过滤器滤过，即得。

2.4 线性关系考察精密吸取浓度为0.108 8 mg/mL的绿原酸对照品溶1.0、2.0、3.0、5.0、8.0、10.0 μL依次进样测定。以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y=1 186.6X+ 87.123（r=0.999 9），结果表明绿原酸在0.108 8~ 1.088 μg范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验取浓度为0.108 8 mg/mL的绿原酸对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定绿原酸的峰面积，RSD为0.35%（n=6）。

2.6 稳定性试验称取同一批次桤木花样品1份，按“2.3”项下方法操作，按“2.1”项色谱条件在0、2、4、6、8、12 h进样测定，得绿原酸峰面积的RSD为 0.68%，结果表明样品溶液在12 h内稳定。

2.7 重复性试验称取同一批次桤木花样品6份，按“2.3”项下方法操作，按“2.1”项色谱条件进样分析，结果绿原酸含量的平均值为1.045 mg/g，RSD为1.36%（n=6）。

2.8 回收率试验精密称取已知绿原酸含量（1.045 mg/g）的桤木花样品6份，每份约0.5 g，分别精密加入0.544 mg/mL的对照品储备液1 mL，加60%甲醇24 mL，密塞，称重，超声提取30 min，用60%甲醇补足减失重量，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，按“2.1”项色谱条件测定，计算回收率，见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

2.9 样品含量测定分别称取采自大理苍山三个不同地点的桤木皮、叶、木质、花、果实样品粉末各1g，采用“2.3”项制备样品液，并在“2.1”项色谱条件下对其绿原酸的含量进行测定，见表2。

表2 桤木各部位中绿原酸的含量测定结果（n=3）

3 讨论

实验分别以不同提取时间，不同甲醇浓度考察川滇桤木各部位中绿原酸的提取工艺，实验结果表明用60%甲醇超声提取30 min可将各部位中绿原酸提取完全。

实验分别测定了川滇桤木皮、叶、木质、花、果实中绿原酸的含量，结果表明花中绿原酸的含量最高，达1.2 mg/g（0.12%），与《中国药典》2010年版一部收载的杜仲叶（≥0.080%）、忍冬藤（≥0.10%）、菊花（≥0.20%）药材中绿原酸的含量相当，低于药典中绿原酸含量较高的金银花（≥1.50%）〔8〕，但仍具有一定的开发利用价值。

在进行流动相的选择时，实验比较了甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液等多种不同配比，结果流动相为乙腈-0.4%磷酸（8∶92）时出峰时间适当，绿原酸与邻峰能达到较好基线分离，峰的对称性好，故选择乙腈-0.4%磷酸（8∶92）为该实验的流动相。

本实验建立的高效色谱法测定桤木中绿原酸的含量，方法简便、快捷，灵敏度高，稳定性好，测定结果准确可靠，适用于川滇桤木各部位中绿原酸的含量测定。

〔1〕怡悦.从日本桤木提取物分离的抗氧化物质及其构效相关性〔J〕.国外医学：中医中药分册，2002，24（4）：249.

〔2〕陈睿，张国林.尼泊尔桤木和崖角藤的化学成分研究〔D〕.北京：中国科学院研究生院，2007.

〔3〕田珍.俄雷冈桤木中的抗肿瘤成分〔J〕.国外医学：药学分册，1974，4.

〔4〕郗砚彬，王金.日本桤木中新的二芳基庚烷类化合物及其抗氧化活性〔J〕.国际中医中药杂志，2006，28（2）：103.

〔5〕刘军海，裘爱泳.绿原酸及其提取纯化和应用前景〔J〕.粮食与油脂，2003（9）：44.

〔6〕吴卫华，康桢，欧阳冬生，等.绿原酸的药理学研究进展〔J〕.天然产物研究与开发，2006，18（4）：691.

〔7〕林宏.金银花药理研究进展〔J〕.江西中医学院学报，2009，21（6）：82.

〔8〕国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部〔S〕.北京：中国医药科技出版社，2010，154-206.

（责任编辑 李杨）

Determination of Chlorogenic Acid in Alnus ferdinandi-coburgii by HPLC

YIN Lamei,YANG Xiaozhen,CAO Yanhua,LIU Ting,XIAO Peiyun*
（College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To establish an HPLC method for the determination of chlorogenic acid in Alnus ferdinandi-coburgii. Methods:We applied highly effective liquid phase chromatography,with Venusil X BP-C18column（150 mm×4.6 mm,5 μm）and mobile phase consisted of acetonitrile-0.4%phosphoric acid solution（8∶92）at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 324 nm,and column temperature was 25℃.Results:There was good linearity in the range of 0.108 8-1.088 μg（r=0.999 9）of chlorogenic acid.The average recovery was 98.98%,RSD was 0.77%（n=6）.Conclusion:The method above was simple,sensitive, accurate,reproducible,and could be applied in the measurement of chlorogenic acid in Alnus ferdinandi-coburgii.

Alnus ferdinandi-coburgii;chlorogenic acid;HPLC

R284

A

1672-2345（2013）06-0020-03

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.06.006

大理学院大学生科研基金资助项目（DXSKYYX201318）

2013-03-28

2013-04-19

尹腊梅，药学专业2010级本科生. *通信作者：肖培云，教授.