鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶研究进展

杜翠红，曹敏杰*

(集美大学生物工程学院，福建 厦门 361021)

鱼类的肌肉中普遍存在一种肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase，MBSP)。该酶可有效降解肌原纤维中的肌球蛋白重链(myosin heavy chain，MHC)，对α-辅肌动蛋白、肌动蛋白和原肌球蛋白也具有不同程度的降解作用。在鱼糜制品生产过程中，MHC的降解作用被认为是导致凝胶劣化的主要因素。因此，本实验室多年来一直致力于不同鱼类MBSP的分离纯化及其酶学性质研究。研究发现，MBSP是一种与胰蛋白酶性质相似的蛋白酶，但其热稳定性优于哺乳动物的胰蛋白酶。在现代蛋白质化学研究中，常用胰蛋白酶或蛋白内切酶Lys-C作为工具酶将蛋白质降解为小肽段后进行质谱鉴定。但胰蛋白酶的热稳定性差，而蛋白内切酶Lys-C价格偏高，影响了其实际使用。因此，将MBSP开发为蛋白质质谱鉴定中的工具酶，具有很好的应用前景和商业价值。本实验通过基因重组技术获得了重组MBSP并实现其体外高效表达，为大规模生产MBSP奠定基础。

1 鱼类MBSP的分离纯化及其特性研究

1.1 鱼类MBSP的分离纯化

对于鱼类MBSP的研究早在20世纪60年代由日本研究者开展，目的是解明鱼糜制品在50～65℃条件下长时间加热而引起的凝胶强度下降的原因[1]。但由于MBSP在鱼肉中含量很低，又与肌原纤维蛋白结合，很难用常规的方法将其从肌原纤维中解离出来，因此，对MBSP的分离纯化就成为对其进行深入研究的瓶颈。直到1997年，Osatomi等[2]从淡水鲤鱼(Cyprinus carpio)肌肉中纯化得到了MBSP。所采用的分离纯化方法的主要特点是首先将肌原纤维蛋白在高盐浓度(2.0mol/L KCl)下进行酸处理(pH 4.0)，使肌原纤维蛋白变性而实现与MBSP的分离；然后将粗酶液浓缩后进行凝胶过滤层析使其得到初步纯化；而后采用Arginine-Sepharose4B柱亲和层析，最终获得电泳级纯度的MBSP。但从3.0kg的鲤鱼肌肉中仅获得约75μg的MBSP纯品，由此可见鲤鱼肌肉中MBSP的含量极低是其分离纯化困难的原因之一。分别采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和凝胶过滤层析对MBSP蛋白进行分子质量检测，结果显示它是一种分子质量为28kD的单亚基蛋白。随后，本研究采用类似的纯化方法分别得到了部分纯化的白鲢鱼MBSP[3]和高度纯化的鲫鱼MBSP[4]，它们均为28kD左右的单亚基蛋白。以上研究结果为其他淡水鱼类的MBSP分离纯化提供了重要参考，同时也为淡水鱼MBSP的酶学特性研究提供了保证。然而，采用类似的分离纯化方法却无法得到海水鱼MBSP，而需要对其纯化方法进行改进。2000年，Cao等[5]将海水狗母鱼的肌原纤维在55℃、pH6.0条件下加热处理5min，实现了肌原纤维蛋白与MBSP的分离。然后分别进行阴离子交换层析、凝胶过滤层析、羟基磷灰石层析和亲和层析，最终得到了纯化的MBSP。分别采用还原型和非还原型SDS-PAGE对MBSP进行检测，结果表明该酶为60kD左右的同源二聚体。海水鱼和淡水鱼MBSP的纯化方法之所以差异较大，可能是由于它们与肌原纤维蛋白的结合方式及MBSP的一级结构和理化性质不同所致。

1.2 鱼类MBSP的酶学特性研究

关于鱼类MBSP的酶学特性主要从底物特异性和蛋白酶抑制剂对其影响、最适温度和热稳定性及最适pH值和pH值稳定性等方面进行研究。底物特异性研究表明，淡水鲤鱼、鲢鱼和鲫鱼的MBSP均可以通过切割精氨酸或赖氨酸残基的羧基端而水解底物[2-4]。其中，对荧光底物Boc-Gln-Arg-Arg-MCA水解效率最高，同时对于胰蛋白酶的其他底物均有不同程度的水解，而且对精氨酸残基的分解能力是赖氨酸残基的5倍左右。但不能水解胰凝乳蛋白酶作用的底物，这不同于从白姑鱼(White Croaker)[6]和六齿金钱鱼 (Threadfi n-Bream)[7]肌肉肌浆蛋白中纯化的胰蛋白酶型的丝氨酸蛋白酶。而来自海水鱼狗母鱼的MBSP特异分解精氨酸残基，对赖氨酸残基无效[5]。根据不同酶抑制剂对酶活性影响的研究结果显示，大部分胰蛋白酶抑制剂(如DFP、STI及TLCK等)均可不同程度地抑制鱼类MBSP的活性[2-5]，但常用的丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF却不能抑制MBSP的活性，这与从老鼠肠黏膜中纯化的膜结合型特异识别精氨酸的丝氨酸蛋白酶[8]和肾上腺嗜铬颗粒中的丝氨酸蛋白酶的特性相似[9]。综合以上有关底物特异性和蛋白酶抑制剂的影响结果表明，鱼类MBSP是一种与胰蛋白酶性质类似的丝氨酸蛋白酶。淡水鱼鲤鱼、鲢鱼和鲫鱼MBSP的最适温度和最适pH值均为55℃和8.0[2-4]；而海水鱼狗母鱼MBSP的最适温度为50℃、最适pH值为7～8[5]。在底物特异性方面，海水鱼狗母鱼MBSP特异分解精氨酸残基，而对赖氨酸残基几乎不产生分解。可见海水鱼和淡水鱼的MBSP在酶学性质上也存在差异。

1.3 鱼类MBSP对肌原纤维蛋白的分解及MBSP抑制剂的研究

为了研究鱼类MBSP对其自身肌原纤维蛋白的分解情况，本实验研究了白鲢鱼肌肉中MBSP的作用。SDSPAGE结果显示，肌原纤维蛋白在55～60℃条件下加热后MHC有明显的分解现象，长时间加热也导致α-辅肌动蛋白、肌动蛋白和原肌球蛋白的分解[10]。通过添加丝氨酸蛋白酶抑制剂和免疫印迹法证实，肌原纤维蛋白的分解是由于白鲢鱼肌肉中存在的MBSP的作用所致。同时，通过考察纯化的MBSP对肌原纤维蛋白的水解结果显示，淡水鲤鱼、鲢鱼和鲫鱼的MBSP在55～60℃之间可有效降解肌原纤维蛋白中的MHC，对α-辅肌动蛋白、肌动蛋白和原肌球蛋白也有不同程度的降解作用[2-3,9]。由于MHC是鱼糜制品中形成凝胶的主要成分[11-12]，为了验证MBSP对鱼糜制品凝胶劣化的影响，Cao等[13]制备了添加MBSP和不添加MBSP的淡水鲤鱼鱼糜制品，并在不同温度下考察了鱼糜的凝胶强度。结果显示，在55～60℃之间，添加MBSP的鱼糜制品的凝胶强度明显低于不添加MBSP的鱼糜制品，由此证明MBSP是引起鱼糜制品凝胶劣化的主要因素之一。最近，本实验以海水鱼蓝圆鲹为研究对象，综合比较了组织蛋白酶L和MBSP对肌原纤维蛋白的分解能力，发现MBSP对肌球蛋白重链和原肌球蛋白的分解较组织蛋白酶L更强[14]。

为了改善鱼糜制品加工过程中的凝胶劣化现象，本实验室通过在鱼糜制品中添加大豆、绿豆胰蛋白酶抑制剂，发现可有效抑制肌原纤维蛋白的降解，进一步证实了丝氨酸蛋白酶MBSP参与鱼糜凝胶劣化的重要事实[15-16]。虽然国内外对于丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究已有很多报道，但大多数抑制剂均是作用于整个丝氨酸蛋白酶家族，而特异性针对某一种特定丝氨酸蛋白酶的报道却不多。2000年，Cao等[17]从白姑鱼肌肉中首次发现了一种特异抑制白姑鱼MBSP的抑制剂(MBSPI)，并分别从蛋白质一级结构、酶学性质和免疫交叉反应等角度证实MBSPI实际上是葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose phosphate isomerase，GPI)。随后，在海水狗母鱼肌肉中也发现了GPI同样具有MBSPI的功能[18]，但狗母鱼GPI对鲤鱼的MBSP没有抑制作用，表明该抑制剂具有种属特异性。2009年，Sun等[19]对淡水鲫鱼GPI也进行了分离纯化，研究表明鲫鱼GPI对其自身的MBSP有特异的抑制效果，而对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及白姑鱼MBSP均无抑制作用，从而说明该GPI为一种特异的丝氨酸蛋白酶抑制剂。通过鲫鱼GPI对其自身MBSP的抑制动力学研究表明，GPI是MBSP的可逆竞争性抑制剂。以上研究结果为开发和研究鱼类MBSP抑制剂奠定了基础。最近，张宾等[20]研究了豆类胰蛋白酶抑制剂对鲢鱼鱼糜凝胶劣化的影响。结果显示，与空白对照相比，添加0.5%～1.0%胰蛋白酶抑制剂的鲢鱼鱼糜凝胶的自溶降解速度和蛋白溶解度明显受到抑制，且保水能力和凝胶强度显著增强。由此可见，来源于大豆、绿豆等豆类的胰蛋白酶抑制剂可作为MBSP的抑制剂，用于鱼糜制品。

2 鱼类MBSP蛋白的N末端测序及其分子生物学研究

为了获得鱼类MBSP蛋白的一级结构信息，我们先后将高度纯化的鲤鱼MBSP和鲫鱼MBSP进行了N末端测序，鲤鱼MBSP获得了40个氨基酸残基序列[21]，而鲫鱼MBSP则获得了27个氨基酸残基序列[4]。二者的前27个氨基酸序列比对结果显示它们有85%的同源性。将鲤鱼MBSP的前40个氨基酸残基序列与其他丝氨酸蛋白酶相比发现在两个特定区域具有很高的相似性，其第40位上的组氨酸残基(His40)被认为是丝氨酸蛋白酶的活性位点之一[21]。由于鲤鱼MBSP和鲫鱼MBSP的部分氨基酸序列在蛋白或核酸序列数据库中并不存在，由此推测鱼类MBSP是一类新型的丝氨酸蛋白酶。

根据鲤鱼MBSP和鲫鱼MBSP的N末端氨基酸残基序列设计MBSP上游简并引物，依据大多数丝氨酸蛋白酶的活性位点保守区域设计下游简并引物，分别利用RT-PCR、3’-RACE和5’-RACE等技术获得MBSP的全长cDNA。先后完成了鲫鱼、鲤鱼和鲢鱼3种淡水鱼MBSP基因全序列的分子克隆[4,22]，其中鲫鱼和鲢鱼MBSP的全长cDNA序列已登录GenBank数据库(登录号分别为DQ872434和EU661606)。测序结果显示鲫鱼MBSP的cDNA含有一个编码242个氨基酸残基的729bp大小的开放阅读框。而根据N末端测序结果和生物信息学分析得知该蛋白带有一个含20个氨基酸残基的信号肽，其成熟蛋白含222个氨基酸残基；而鲤鱼和鲢鱼MBSP的开放阅读框编码243个氨基酸残基，其信号肽含21个氨基酸残基，因此，其成熟蛋白也含222个氨基酸残基。通过对这3种鱼的MBSP氨基酸序列进行比对，发现鲢鱼和鲤鱼MBSP成熟蛋白的相似性高达98.2%，而鲢鱼与鲫鱼MBSP成熟蛋白的相似性为80.63%。此结果为国际上首次报道的关于鱼类MBSP一级结构信息。从而为进一步研究鱼类MBSP的结构与功能关系和MBSP的重组表达奠定了基础。

将鲫鱼MBSP氨基酸序列与其他丝氨酸蛋白酶(主要是不同来源的胰蛋白酶)氨基酸序列进行比对，结果显示鲫鱼MBSP与其他丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列的相似性在36%～55%之间。其中，与大麻哈鱼胰蛋白酶的相似性为54.5%[23]；与鳕鱼胰蛋白酶的相似性为52.2%[24]；与猪胰蛋白酶的相似性为55.1%[25]；与人胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶(KLK14)的相似性为47.2%[26]；与仓鼠的胰凝乳蛋白酶型丝氨酸蛋白酶的相似性为36.2%[27]。但这些酶在活性位点保守区域的相似度很高，与组成丝氨酸蛋白酶催化中心三联体[28]对应的氨基酸残基分别位于鱼类MBSP成熟蛋白氨基酸序列中的His40、Asp86和Ser176[4]。由此推测鱼类MBSP与胰蛋白酶的催化机制类似，但需要通过定点突变等手段进一步验证。

3 鱼类MBSP的重组表达及其酶学特性研究

3.1 鱼类MBSP的重组表达

由于天然MBSP蛋白在鱼体肌肉中含量极低，分离纯化难度较大，收率低。为了获得大量的MBSP，本研究室根据MBSP的cDNA序列，采用基因重组技术，将鲫鱼MBSP基因与pQE30表达载体连接，实现了MBSP在大肠杆菌中的高效表达和纯化。重组MBSP的表达量可达菌体总蛋白的15%以上。由于重组MBSP中带有(His)6标签，利用固定金属离子亲和层析可简单实现该重组蛋白的纯化。然后，将高度纯化的重组MBSP蛋白免疫小鼠，首次制备了抗MBSP特异性多克隆抗体，为今后对该蛋白酶的深入研究提供了有力的检测工具。

然而，由于在大肠杆菌中表达的重组MBSP主要为包涵体形式，复性、纯化后不具有生物学活性。为此，本研究室利用毕氏酵母表达系统对该蛋白进行分泌表达。将鲫鱼MBSP成熟蛋白基因借助表达载体pPIC9K整合到毕氏酵母表达宿主GS115的染色体上构建了重组酵母表达菌株[29]。由于在目的基因的上游存在乙醇氧化酶基因(AOX1)启动子和一个酵母信号肽序列，该重组菌株经甲醇诱导表达后，可在发酵液上清中获得重组MBSP。SDSPAGE电泳和免疫印迹检测结果显示重组MBSP的分子质量为36kD左右，而天然MBSP和大肠杆菌表达的重组MBSP均为28kD左右。这可能是由于该重组MBSP蛋白中含羟基的氨基酸残基在酵母中发生了糖基化反应。为此，我们又对该重组MBSP进行了糖含量测定[30]和PAS染色[31]，发现该重组蛋白中糖含量为10.5%，且可以产生PAS显色反应，由此证明酵母表达的重组MBSP为糖蛋白。

3.2 重组MBSP的酶学特性研究

为了比较重组MBSP和天然MBSP的酶学特性，我们考察了酵母表达的重组MBSP的底物特异性、最适温度和温度稳定性及最适pH值和酸碱稳定性[29]。结果显示重组MBSP最适温度和最适pH值分别为55℃和7.5，与天然MBSP类似。而重组MBSP的热稳定性略低于天然MBSP，在60℃条件下加热30min后，天然MBSP酶活性仍保留80%，而重组MBSP酶活性残留40%。但在25～55℃条件下加热30min后，重组MBSP酶活性仍保留80%以上，其热稳定性同样优于胰蛋白酶和蛋白内切酶Lys-C。另外，重组MBSP在pH5.0～8.5之间酶活性仍保留75%以上，说明其具有良好的酸碱稳定性。然而，重组MBSP在底物特异性方面却与天然MBSP差异很大，其只能识别赖氨酸残基的羧基端，而对精氨酸无效，这与蛋白内切酶Lys-C的底物特异性类似。分析原因可能是由于重组MBSP在毕氏酵母中被糖基化或蛋白表达后在折叠过程中底物结合部位发生了结构上的变化，从而改变了其底物特异性。因此，还需要进一步通过去糖基化反应或表达其他鱼的MBSP等实验进行验证。同时，我们还考察了重组MBSP对鲫鱼肌原纤维蛋白的降解情况，结果与天然MBSP的降解性能类似[29]。

4 鱼类MBSP的应用前景及展望

目前在蛋白质的质谱鉴定中，常用胰蛋白酶或蛋白内切酶Lys-C将蛋白质降解为小肽段后进行质谱分析，从而获得该蛋白质的肽指纹图谱[32-33]。由于重组MBSP具有良好的热稳定性和酸碱稳定性及对赖氨酸残基羧基端特异分解的底物特异性，因此该类蛋白酶有望作为替代胰蛋白酶或蛋白内切酶Lys-C等工具酶而应用于蛋白质化学、蛋白质组学研究。目前我们已成功构建了重组MBSP的毕氏酵母表达菌株，需要进一步优化其高密度发酵条件并建立一套经济合理的纯化工艺，以大规模生产重组MBSP。

尽管目前关于鱼类MBSP的分离纯化、酶学特性及分子生物学等方面已作了大量研究，但其与肌原纤维蛋白的结合方式、催化机制以及结构与功能关系等问题还需要通过免疫组织化学、生物信息学分析和定点突变等手段进行深入研究，以期为开发新型的蛋白酶提供理论依据。

[1] TOYOHARA H, SAKATA T, YAMASHITA K, et al. Degradation of oval-fi lefi sh meat gel caused by myofi brillar proteinase(s)[J]. J Food Sci, 1990, 52： 364-368.

[2] OSATOMI K, SASAI H, CAO M J, et al. Purification and characterization of myofibril-bound serine proteinase from carp (Cyprinus carpio) ordinary muscle[J]. Comp Biochem Physiol Part B, 1997, 116： 183-190.

[3] CAO M J, WU L L, HARA K, et al. Purifi cation and characterization of myofi bril-bound serine proteinase from the skeletal muscle of silver carp[J]. J Food Biochem, 2005, 29： 533-546.

[4] GUO C, CAO M J, LIU G M, et al. Purifi cation, characterization, and cDNA cloning of a myofi bril-bound serine proteinase from the skeletal muscle of crucian carp (Carassius auratus)[J]. J Agric Food Chem, 2007, 55： 1510-1516.

[5] CAO M J, OSATOMI K, HARA K, et al. Identifi cation of a myofi brilbound serine proteinase (MBSP) in the skeletal muscle of lizard fi sh Saurida wanieso which specifi cally cleaves the arginine site[J]. Comp Biochem Physiol Part B, 2000, 125： 255-264.

[6] YANAGIHARA S, NAKAOKA H, HARA K, et al. Purification and characterization of serine proteinase from white croaker skeletal muscle[J]. Nippon Suisan Gakkaishi, 1991, 57： 133-142.

[7] TOYOHARA H, SHIMIZU Y. Relation between the modori phenomenon and myosin heavy chain breakdown in threadfi n-bream gel[J]. Agric Biol Chem, 1988, 52： 255-257.

[8] BOURDAIS J, PIEROTTI A R, BOUSSETTA H, et al. Isolation and functional properties of an arginine-selective endoprotease from rat intestinal mucosa[J]. J Biol Chem, 1991, 266： 23386-23391.

[9] CAO M J, JIANG X J, ZHONG H C, et al. Degradation of myofi brillar proteins by a myofi bril-bound serine proteinase in the skeletal muscle of crucian carp (Carassius auratus)[J]. Food Chem, 2006, 94： 7-13.

[10] 曹敏杰, 李燕, 翁凌, 等. 鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的研究[J]. 食品科学, 2005, 26(1)： 91-94.

[11] CHENG C S, HAMANN D D, WEBB N B. Effect of thermal processing on minced fish gel texture[J]. J Food Sci, 1979, 44： 1080-1086.

[12] TOYOHARA H, SHIMIZU Y. Relation between the modori phenomenon and myosin heavy chain breakdown in thread-bream gel[J]. Agric Biol Chem, 1988, 52： 255-257.

[13] CAO M J, HARA K, OSATOMI K, et al. Myofibril-bound serine proteinase (MBP) and its degradation of myofibrillar proteins[J]. J Food Sci, 1999, 64： 644-647.

[14] ZHONG C, CAI Q F, LIU G M, et al. Purifi cation and characterization of cathepsin L from the skeletal muscle of blue scad (Decapterus maruadsi) and comparison of its role with myofibril-bound serine proteinase in the degradation of myofi brillar proteins[J]. Food Chem, 2012, 133： 1560-1568.

[15] 蒋欣静, 王锡昌, 周常义, 等. 大豆胰蛋白酶抑制剂对白鲢鱼丝氨酸蛋白酶的作用[J]. 水产学报, 2005, 29(4)： 502-506.

[16] SUN L C, YOSHIDA A, CAI Q F, et al. Mung bean trypsin inhibitor is effective in suppressing the degradation of myofibrillar proteins in the skeletal muscle of blue scad (Decapterus maruadsi)[J]. J Agri Food Chem, 2010, 58： 12986-12992.

[17] CAO M J, OSATOMI K, MATSUDA R, et al. Purifi cation of a novel serine proteinase inhibitor from the skeletal muscle of white croaker (Argyrosomus argentatus)[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 272(2)： 485-489.

[18] CAO M J, OSATOMI K, HARA K, et al. Purification of a novel myofi bril-bound serine proteinase inhibitor (MBSPI) from the skeletal muscle of lizard fi sh[J]. Comp Biochem Physiol Part B, 2001, 128(1)： 19-25.

[19] SUN L C, ZHOU L G, DU C H, et al. Glucose-6-phosphate isomerase is an endogenous inhibitor to myofibril-bound serine proteinase of crucian carp (Carassius auratus)[J]. J Agric Food Chem, 2009, 57： 5549-5555.

[20] 张宾, 汪东风, 邓尚贵. 豆类胰蛋白酶抑制剂抗鲢鱼鱼糜凝胶劣化的研究[J]. 食品工业科技, 2012, 33(14)： 107-110.

[21] CAO M J, OSATOMI K, PANGKEY H, et al. Cleavage specificity of a myofibril-bound serine proteinase from carp (Cyprinus carpio) muscle[J]. Comp Biochem Physiol Part B, 1999, 123： 399-405.

[22] GUO C, LIANG Y L, LIU G M, et al. Molecular cloning of a myofibril-bound serine proteinase (MBSP) from common carp (Cyprinus carpio) muscle[J]. J Fisheries China, 2007, 31： 423-430.

[23] TOYOTA E, NG K K, KUNINAGA S, et al. Crystal structure and nucleotide sequence of an anionic trypsin from chum salmon (Oncorhynchus keta) in comparison with Atlantic salmon (Salmo salar) and bovine trypsin[J]. J Mol Biol, 2002, 324： 391-397.

[24] MALE R, LORENS J B, SMALAS A O, et al. Molecular cloning and characterization of anionic and cationic variants of trypsin from Atlantic salmon[J]. Eur J Biochem, 1995, 232： 677-685.

[25] HERMODSON M A, ERICSSON L H, NEURATH H, et al. Determination of the amino acid sequence of porcine trypsin by sequenator analysis[J]. Biochemistry, 1973, 12： 3146-3153.

[26] HOOPER J D, BUI L T, RAE F K, et al. A novel kallikrein serine protease expressed by normal and malignant prostatic epithelium[J]. Genomics, 2001, 73： 117-122.

[27] HOLT J C, HATCHER V B, CAULFIELD J B, et al. Cloning of the cDNA and nucleotide sequence of a skeletal muscle protease from myopathic hamsters[J]. Mol Cell Biochem, 1998, 181： 125-135.

[28] BARRET A J, RAWLINGS N D, WOESSNER J F. Handbook of proteolytic enzymes[M]. Holland： Elsevier Academic Press, 2004： 1417-1439.

[29] DU C H, HAN L, CAI Q F, et al. Secretory expression and characterization of the recombinant myofi bril-bound serine proteinase of crucian carp (Carassius auratus) in Pichia pastoris[J]. Comp Biochem Physiol Part B, 2013, 164： 210-215.

[30] LIU X H, CHEN Y G, LIN L, et al. Comparison of methods in determination of polysaccharide in Lycium barbarum L.[J]. Food Sci Technol, 2009, 9： 270-272.

[31] 曹佐武. 糖蛋白PAGE分离后的糖基显色法[J]. 生物技术通报, 2006(5)： 87-89.

[32] RUAN M M, WU J M. Trypsin immobilized in sol-gel for highthroughput protein peptide mapping[J]. Chin J Anal Chem, 2006, 34： 1707-1710.

[33] GADGIL H S, BONDARENKO P V, PIPES G D, et al. Identifi cation of cysteinylation of a free cysteine in the Fab region of a recombinant monoclonal IgG1 antibody using Lys-C limited proteolysis coupled with LC/MS analysis[J]. Anal Biochem, 2006, 355： 165-174.