异丁醇生物合成的研究进展
2013-04-10田宇王义强王启业
田宇 王义强 王启业
(中南林业科技大学 生物技术实验室,长沙 410004)
目前,石油、煤炭及天然气等化石燃料在价格不断上涨的同时,正面临资源枯竭的危险[1]。发展生物燃料已成为许多国家提高能源安全、减排温室气体、 应对气候变化的重要措施。当前市场上的生物燃料以燃料乙醇和生物柴油最为常见,异丁醇与这些生物燃料相比具有高能量密度和低吸湿性等优势,因此被作为一种补充或替代汽油的新型生物燃料加以重点研究。除作为生物燃料外,异丁醇也是合成增塑剂、防老剂、人工麝香、果子精油和药物的重要原料,还是生产涂料、清漆的重要配料,并可作为正丁醇的代用品。异丁醇还可以脱水生成具有更高价值的异丁烯,作为塑胶及柴油机燃料的原料[2]。因此,异丁醇的研究开发日益受到许多国家的重视。
1 异丁醇生产技术与现状
长久以来,异丁醇作为重要的中间物质被用于食品、医药和化工等多个行业[3]。作为新型生物燃料,异丁醇有其独特的优势,更具有广阔的发展前景。异丁醇具有不易吸水、挥发性低等特点,异丁醇的运输可以直接利用现有的汽油输送管道及分销渠道,且异丁醇对汽车引擎造成的损伤更小,现有汽车引擎可直接使用,不需要掺入汽油,同时与生产1 gal的乙醇相比,生产1 gal的异丁醇所需要消耗的能量更少,且能多生产至少50%的可用能源[4]。异丁醇代替生物乙醇作为汽车燃料有很大的可能性[5]。
目前生产异丁醇主要分成化学合成法和生物合成法两大类,其中化学合成法占主导地位。化学合成法主要有以下3种方法:(1)丙烯羰基合成法[6]是在由丙烯和合成气制取正丁醇和2-乙基己醇工业中副产异丁醛经加氢制得;(2)合成气在Cu-Mg催化剂作用下合成甲醇中得到异丁醇[7];(3)由Zn-Cr氧化物催化剂低碳醇生产异丁醇[8]。目前,世界上主要还是通过是丙烯羰基合成法生产异丁醇。化学方法合成的异丁醇工艺繁琐,催化剂价格高。同时,随着近年来石油价格的高涨与持续减少和异丁醇需求的增长,再加之羰基合成醇装置的盈利利润不高,一些欧洲生产商关停部分装置,而转向其他产品发展,使得异丁醇供应形势十分紧张。虽然几年来,国内的羰基醇装置的建成和调整装置,使异丁醇供需矛盾将有一定改善,但是由于生产异丁醇原料的严重不足和催化剂价格昂贵,导致异丁醇供应不能满足当前的需要,市场缺口仍然很大。生产异丁醇的原料供应对化学法大量合成异丁醇形成了严重制约,并且在合成过程中造成的严重环境问题,使人们不得不寻找新的异丁醇合成方法,同时更加意识到生物合成异丁醇具有良好的发展前景。
但生物合成法生产的异丁醇主要是通过粮食发酵生产正丁醇中的少量副产。因此,利用生物合成法直接发酵生产异丁醇被视为未来发展的重要方向[9]。
2 异丁醇生物合成研究现状
燃料乙醇和丁醇已经通过酿酒酵母和丙酮丁醇羧菌发酵生产达到了工业化的程度[10,11],而到目前为止,一直没有发现有原始菌株可以直接合成异丁醇。1998年,Dickinson等[12]研究了酿酒酵母中缬氨酸代谢途径中异丁醇的合成途径,但其是把它作为缬氨酸代谢的微量副产物,不能达到工业化生产的要求。 就目前的市场而言,如果要使发酵法生产异丁醇在工业化方面较化学法更具有竞争力,发酵法必须拥有短时间内达到较高产量和成本较低的特点。传统的发酵菌株不能够满足工业化生产的需要,因此我们需要对异丁醇生产的宿主菌株进行改造,提高其对产物的耐受力、原料利用率等性状[13]。2008年Atsumi等[14]利用代谢工程手段对大肠杆菌进行了改造,使其能够利用葡萄糖生产异丁醇,为构建高产异丁醇基因工程菌提供了新的思路,开启了生物合成异丁醇的大门。目前用于合成异丁醇研究的菌株主要有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母等。下面对这几种菌的基因工程改造、生物合成异丁醇的研究现状与进展进行综述。
2.1 大肠杆菌(Escherichia coli)生物合成异丁醇
E. coli培养条件简单,生长迅速,底物范围广,可发酵戊糖和己糖,有工业化生产的先例(生产重组蛋白),并且传统醇类(如燃料乙醇)发酵也以大肠杆菌工程菌进行。2008年,Atsumi等[14]发表在Nature杂志上的文章表明,异丁醇的生物合成途径是:在2-酮酸脱羧酶(kivd)作用下,前体物质2-酮异戊酸脱羧生成为异丁醛,然后由乙醇脱氢酶(Adh2)将异丁醛还原为异丁醇。在启动子PLlacol的作用下过度表达ilvHCD基因和敲出在合成异丁醇途径中产生的副产物的adhE、dhA、frdAB、pflB、fnr和pta等基因,然后用转移性更高的枯草芽孢杆菌的alsS基因替换活性较低的ilvH基因。经此改造后的工程菌,发酵110 h后异丁醇的产量可高达22 g/L,相当于理论值的86%。2009年,Potera[2]在发表的文章中阐述了美国杜邦公司已运用此方法生产异丁醇。2010年,郭媛等[15]将酿酒酵母菌株中的2-酮酸脱酸酶基因(aro10)及乙醇脱氢酶基因(Adh2)导入工程菌,同时缺陷pflB、frdAB和fnr等3个基因,成功构建了可以利用蔗渣生产异丁醇的工程菌菌株。同年,Ekaterina 等[16]成功将乙酰羟酸合成酶、乙酰羟酸同分异构体还原酶(ilvC)、二羟酸脱羧酶(ilvD)、2-酮酸脱酸酶(kivd)和乙醇脱氢酶(Adh2)等基因引入大肠杆菌,构建了工程菌,结果表明,该工程菌可以利用葡萄糖产生异丁醇,在有氧条件下异丁醇产量到达1.5%。2011年,林丽华等[17]将2-酮酸脱羧酶基因(kdcA) 克隆到大肠杆菌缺失型突变株BW25113 中,将这些相关基因串联在一个质粒中表达,发酵24 h,产率达到3 g/L。该研究组进一步将大肠杆菌缺失型突变株BW25113中的pflB、frdAB、fnr和Adh2四个基因敲除,得到工程菌异丁醇产量提高了40%,达到了4.2 g/L[18]。2008年,Atsumi等[14]在大肠杆菌中将几种不同的脱羧酶的编码基因进行了比较,包括来自S. cerevisae的aro10、pdc6和thi3,来自L. lactis的kivd和来自C.aectobutylicum的pdc等。研究结果表明,在异丁醇的合成过程中,kivd编码的脱羧酶活性最高。 2010年,Atsumi等[19]对比了L. lactis中adhA、S. cerevisae中的Adh2中和E. coil中yqhD三个基因在大肠杆菌中的活性,研究表明adhA在大肠杆菌中呈现的异丁醛还原酶的活性最大,所以adhA更适合作为大肠杆菌中还原合成异丁醇的基因。Smith等[20]利用NTG作为诱变剂,对产异丁醇的E. coli JCL16进行诱变筛选,获得了一株产量达到590 mg/L异丁醇的菌株NV1和产量为4.1 g/L的NV2,进一步对NV2进行诱变的得到产量为6.1 g/L的NV3。Bastian等[21]利用定点突变的手段,将E. coil异丁醇合成菌株中的酮酸还原异构酶ilvC与乙醇脱氢酶adhA分别突变,得到的改造菌株E. coilpGVferm6,该菌株在厌氧条件下异丁醇的合成量达到了13.4 g/L,相对原菌种E. coilpGVferm2(2.3 g/L)提高了5.8倍。Thrih等[22]通过研究E. coli合成异丁醇的碳代谢途径,确定了合理的敲除途径,获得了能在厌氧条件下合成异丁醇的E. coli。2012年,潘超强等[23]通过改造仅将kivd和Adh2串联克隆到E. coli中,24 h后异丁醇的生物合成量就达到0.12 g/L。
2.2 枯草芽孢杆菌生物合成异丁醇
随着枯草芽孢杆菌基因图谱的绘制完成,Bacillus subtilis已被作为基因改造和工程菌构建的重要菌株。2008年,Fischer等[13]研究发现,枯草芽孢杆菌的对正丁醇的耐受性较好(异丁醇毒性与其相似),在2.0%正丁醇存在时其生长速率约为大肠杆菌的8倍。与此同时,枯草芽孢杆菌中的alsS基因是对编码对丙酮酸有高度专一性的乙酰乳酸合酶的优势基因。基于以上几点优势,枯草芽孢杆菌也被作为生物合成异丁醇的改造菌株。
2010年,谢夏等[24]将Adh2(S. cerevisae)和kivd(L. lactis)连接到载体上,由p43启动子启动两个基因表达构建重组载体,再导入B. subtilis168中,获得重组菌。然后,通过对重组菌发酵条件进行优化,结果表明在发酵35 h后,异丁醇产量为0.607 g/L。2011年,Li等[25]将外源的乙酰羟酸合成酶基因、乙酰羟酸同分异构体还原酶基因(ilvC)、二羟酸脱羧酶基因(ilvD)、2 -酮酸脱羧酶基因(kivd)和乙醇脱氢酶基因(Adh2)等5个基因引入枯草芽孢杆菌,过度表达乙酰羟酸合成酶基因,异丁醇的产率提高2.8倍。工程菌B. subtilis在微氧条件下发酵,得到的异丁醇产量为2.62 g/L 。Li等[26]构建了B. subtilis异丁醇合成菌的基因组尺度代谢网络模型,该菌株在好氧-微氧双阶段条件下培养,异丁醇产量达到5.5 g/L,较原来菌株异丁醇生物合成量提高了70%。
2.3 其他菌株生物合成异丁醇
除上述几种菌种外,酿酒酵母和谷氨酸杆菌等也有发酵生产异丁醇的报道。早在1998年,Dickinson等[12]的研究结果,表明酿酒酵母内能够通过缬氨酸代谢途径合成异丁醇,但产率不高。Chen等[27]研究表明,酿酒酵母厌氧发酵情况,通过过度表达基因ILV2、ILV3和ILV5,使异丁醇的产量从0.16 mg/g葡萄糖提高到0.97 mg/g葡萄糖。通过BAT2的过度表达,细胞质支链氨基酸的氨基转移酶则可使异丁醇产量进一步提高两倍。Krause等[28]通过失活C. glutamicum菌株中丙酮酸退青梅复合体(PDHC)、苯醌氧化还原酶与氨基转移酶,培养72 h后该菌株kivd生物合成量有明显提高。同时,2011年,张路路等[29]研究结果表明,酿酒酵母耐受丁醇的特性远优于原核生物,耐受浓度达到16 g/L,由此可以看出酿酒酵母很适合作为生物合成异丁醇的宿主菌株。
2010年,Smith等[30]将alsS(Bacillus subtilis)、Adh2、ilvC、ilvD(C. glutamicum)和kivd(Lactococcus lactis)导入谷氨酸棒杆菌中并且过度表达,在适合的条件下分批培养发酵120 h后,异丁醇产率达到了4.9 g/L。Blombach等[31]以缺陷型C. glutamicum为宿主,失活LDH与苹果酸脱氢酶并过度表达E.coli转氢酶PntAB后,菌株在好氧-厌氧双阶段条件下,进行分批-补料发酵异丁醇产量提高到13 g/L。
2009年,Atsumi等[32]对细长集球藻菌进行了基因改造,将酮酸脱羧酶(kivd)基因、alsS基因和来自大肠杆菌的ilvC和ilvD等基因过度表达,在菌液中检测到异丁醇量为0.4 g/L。通过光合作用,转基因蓝藻就可以产生异丁醇。2010年,美国杜邦公司和其合作伙伴 BioArchitecture Lab 获得美国国家资助进行绿藻水产养殖,绿藻转化成可利用的糖,将糖转化为异丁醇的工艺研究。
2011年,Higashide等[33]利用基因改造手段将一株从腐烂的草中分离处能直接利用纤维素的梭菌C. cellulolyticum,该工程菌可以直接利用纤维素合成异丁醇,8 d左右异丁醇产量已达到660 mg/L。
3 小结
随着石油化工的快速发展和化学法合成异丁醇的工业化生产,使得生物合成异丁醇产品缺乏经济竞争力。主要有两方面原因:一是生物合成异丁醇产量低,由于工程菌的2-酮酸脱羧酶的表达量低直接导致异丁醇量低,异源代谢产物及中间产物的积累可能会导致细胞毒性反应影响产率,还有乙醇等的生物合成代谢途径也会降低产率;二是目前的生物异丁醇的合成主要是以葡萄糖为原料生产,生产异丁醇成本太高,并且随着粮食价格的上涨及世界粮食资源的匮乏,以粮食为原料生物合成丁醇的发展必将处于劣势。所以,针对第一种情况,采用基因工程和代谢工程技术,解除代谢过程中可能存在的产物或者中间产物的抑制,构建对异丁醇耐受性更高的基因工程菌株,敲除其他支路的基因、切断其生物合成,寻找自身含有高酶活的2-酮酸脱羧酶菌株等方法均为提高生物合成异丁醇产量的有效途径。对于第二种情况,通过利用廉价非粮类原料生产异丁醇来降低其生产成本,以解决该产业所必须直面的瓶颈问题。
目前,新型生物燃料占全球运输燃料市场的份额不足2%。根据专家的预测,生物燃料在未来运输燃料结构中将占有重要比重,在主要市场中可望达到20%-30%[34]。由于生物异丁醇生产与生物乙醇生产采用相似的工艺,现有的生物乙醇生产设施经过改造便可转而生产生物异丁醇。因此,生物异丁醇的市场潜力巨大。考虑到粮食安全和生产成本的问题,生物异丁醇产业发展的出路在于应用非粮类原料来生产异丁醇,如废糖蜜 、农作物秸秆,木薯和木质纤维等。同时,随着人们对木质纤维素水解研究的深入和纤维素酶成本的降低,此类可再生资源用于异丁醇的发酵生产将成为必然的发展趋势。另外,要增强异丁醇生物合成的经济竞争力,除了采用廉价原料外,还需要运用基因工程和代谢工程等现代分子生物学技术构建优良工程菌,革新生物反应器,采取先进的发酵工艺和有效的回收技术等措施。
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