人酸性成纤维细胞生长因子的研究进展

谭亚清 刘德虎

（中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）

1974年，Gospodarwicz等［1］首次从牛脑垂体中分离纯化出一种促进卵巢细胞系分裂增殖的富含赖氨酸和精氨酸的碱性多肽，并将其命名为成纤维细胞生长因子。成纤维细胞生长因子是一个大的蛋白质家族，到目前为止已发现了不少于23个成员。酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）是由Thomas等［2］于1984年从牛脑中分离纯化得到的，它的等电点为5-7，呈酸性，故以之命名，是第二个被分离纯化的成纤维细胞生长因子家族成员，因此相对应的命名第一个碱性多肽为碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。aFGF是哺乳动物组织中存在的一种正常而微量的物质，主要分布于脑、肾脏等器官或组织中，对来源于中胚层及神经外胚层的多种细胞均具有促分裂作用。因其在促进胚胎发育、器官形成、血管再生、溃疡愈合及创面修复等［3］临床应用多方面作用明显而成为国内外研究的热点。

1 aFGF的结构

人的aFGF基因位于第4号染色体上，是一个由2个大的内含子和3个外显子组成的单拷贝基因。aFGF主要分布于肾脏和脑组织中，是一种胞质蛋白，其本身缺乏N端信号肽结构，主要通过自分泌和旁分泌两种方式对周围细胞起作用。人的aFGF多肽由154个氨基酸残基组成，分子量为16 kD，是一个不含二硫键的全β折叠蛋白，其二级结构是由12条反平行的β链组成的三叶草结构，在人的aFGF机构中，这种三叶草结构并不是单独起作用的，至少存在两个结构上相互独立的功能单位［4］。这种结构与其在功能上的特异性有着密切联系，它的功能区主要包括肝素结合区、受体结合区和核转位区。

1.1 肝素结合区

该区域分布大量的带正电荷的碱性氨基酸残基，通过与带负电荷的肝素相结合激活aFGF受体。肝素是一类糖胺聚糖，aFGF与之结合后接触面游离蛋白质的熔解温度升高，三级结构的构象发生改变，由此导致其稳定性和活性都增加［5］。此外，与肝素结合后还能防止其被热、极性pH变性及蛋白酶水解。1993年，Margalit等［6］用计算机图形技术分析肝素与蛋白结合的三维结构发现，不同蛋白与肝素结合区域的碱性氨基酸有着共同的空间分布特点，这种分布形成了可容纳肝素的空隙，从而使肝素和蛋白交织在一起，进而影响蛋白的生物学活性。

1.2 受体结合区

人酸性成纤维细胞生长因子通过激活特定的横跨膜的酪氨酸激酶受体起作用。酸性成纤维细胞生长因子受体（acidic fibroblast growth factor receptor，aFGFR）由3部分组成：3个免疫球蛋白样结构域（D1、D2和D3）组成的胞外配体结构域、跨膜螺旋结构域和胞质分散的酪氨酸蛋白激酶结构域。aFGFR主要包括4种紧密联系的亚型：即FGFR1-4。aFGFR不仅能与aFGF结合，还能与FGFs家族的其他成员相结合，因此不具特异性［7］。对晶体结构研究发现，aFGF与aFGFR配体的特异性结合主要决定于胞外结构域D2和D3以及它们之间的仅由4个氨基酸残基组成的连接肽段：aFGF与FGFR2的配体结构域中的D2的作用部位是β1、β1/β2转角、β3/β4 环、β9、β10/β11环、β12和C末端；与D3作用的位点部位是β4/β5发夹、β6、β7/β8环、β8和N端的第5-9位氨基酸残基；与连接肽段的作用部位是N末端、β8、β9和β12［8］。

1.3 核转位区

aFGF能通过非经典的跨膜机制进入细胞核促进细胞分裂和DNA的合成，称为核转位。这一过程依赖于aFGF N末端的27个氨基酸残基，特别是第21-27位之间的核定位序列（nuclear localization sequence，NLS）：Asn-Tyr-Lys-Lys-Pro-Lys-Leu，也称为核转位区，其对aFGF的促有丝分裂活性十分重要。去除该序列后，aFGF虽然仍能被膜表面受体识别并引发早期促有丝分裂事件如胞内受体介导的酪氨酸磷酸化和c-los的表达，但是丧失了诱导DNA合成和细胞增殖的能力［9］。Lin等［10］认为，aFGF的NLS在促有丝分裂活性中存在两方面功能：（1）介导aFGF的核转位：aFGF与受体结合后进入胞内，通过NLS与胞内组织相结合促进aFGF的核转移；胞内aFGF单体可以通过自由扩散的方式进入细胞核，而对于aFGF-aFGFR复合物形式的转位，这个作用就是必须的。（2）直接参与aFGF诱导核促分裂作用信号的产生，这可能是由NLS与核内或核膜上特定分子的结合引起的。因此，去除NLS的aFGF的改构体也就丧失了核转位能力和促有丝分裂能力。

2 aFGF的生物学功能

haFGF具有广泛的生物学活性，能够通过和受体结合实现对中胚层及神经外胚层来源的多种细胞的生长、分化及功能产生影响。其生物学活性分为两大类型：（1）促有丝分裂活性，可促进组织细胞分裂、增殖，包括胚胎发育、形态发生、血管生成及组织损伤修复等；（2）非促有丝分裂活性，包括舒张血管、心肌保护、局部缺血保护和神经保护等。

2.1 胚胎发育

Fu等［11］研究大鼠胚胎发现，aFGF广泛分布于大鼠胚胎的中胚层和神经外胚层组织中，在胚胎发育过程中随着细胞的生长、迁移和分化而不断变化。aFGF能增加胚胎早期转录因子的表达，诱导背侧中胚层的形成，因此被视为胚胎早期背侧发育的营养因子。在对爪蟾的研究发现，aFGF及FGFR作为中胚层的诱导因子集中分布在半球，低水平刺激酪氨酸蛋白激酶信号转导途径，维持中胚层基因的表达，诱导中胚层的形成［12］。

2.2 血管生成

haFGF可以直接参与新生血管的形成过程。章斌等［13］向内皮细胞的培养液中加入一定量的aFGF，结果发现，其对血管内皮细胞的生长有非常明显的促进作用，而血管内皮细胞的增殖和分化是血管新生的重要环节。aFGF发挥促血管生成作用尚需有组织缺血、缺氧的因素存在，在正常组织内，aFGF无促进血管生长的作用，在缺血或缺氧的状态下，组织对aFGF的表达上调，刺激毛细血管内皮细胞产生胶原酶和纤维蛋白水解酶，促进胶原的水解和血管内皮细胞管腔样结构的形成［14］。

2.3 损伤修复

皮肤的创伤修复是一个复杂的动态的生物学过程，aFGF在这个过程中发挥着重要作用：趋化炎细胞浸润创面，促进血管内皮细胞和成纤维细胞分裂增殖，加速肉芽组织形成和创面的再上皮化，抑制胶原纤维的过量形成，避免瘢痕的产生。刘炘等［15］通过大鼠创伤模型观察重组人酸性成纤维细胞生长因子在创面愈合中的作用发现，aFGF在创面愈合的前期可以促进肉芽组织生长，加快伤面愈合；后期又可直接或间接的促进成纤维细胞的凋亡，维持细胞增殖与凋亡的平衡，避免瘢痕组织的形成。aFGF能促进血管内皮细胞、平滑肌细胞和肌纤维母细胞等多种细胞的分裂增殖并能诱导血管新生，因此其对内脏的缺血性损伤亦有保护作用。研究发现，肠缺血-再灌注损伤后注射aFGF，一段时间后测得肝肾功能指标：丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、血尿素氮和血肌酐均有升高，说明aFGF对肠缺血-再灌注损伤后的肝、肾功能均有保护作用［16］。转基因小鼠心肌特异性过表达人类aFGF，其微动脉和主冠状动脉分支的数目明显增多，从而使冠状动脉的血流量增多，延缓心肌梗塞面积的扩大，降低心肌缺失损伤，保护心肌［17］。因此，将aFGF同时用于促进皮肤组织损伤的修复与内脏缺血性损伤的修复，显示出aFGF在临床应用的极大优越性。

2.4 神经营养

在体外培养条件下，aFGF能对多种神经元如海马、下丘脑、脊髓等中枢性神经元及睫状体、视网膜等外周性神经元有神经营养作用。aFGF能促进神经元的存活和轴突的生长。Li等［18］研究发现，向大鼠腹膜腔或侧脑室注射葡萄糖能够有效的改善大鼠的记忆功能。这是因为注射葡萄糖后大鼠脑室的室管膜细胞会产生aFGF，经过2 h扩散到下丘脑、海马等大脑软组织，aFGF通过作用于海马从而促进记忆功能的改善。aFGF对视神经元同样具有营养作用，在对新生大鼠的视网膜神经节细胞的培养发现，结合肝素的aFGF具有促进轴突的起始和延伸的作用［19］。此外，aFGF还能够促进中枢神经和外周神经损伤后的修复和再生，研究证实aFGF能够促进成年大鼠切断脊神经根的功能性复原［20］。

2.5 骨骼生长

aFGF通过影响软骨细胞和成骨细胞的活动从而促进骨骼生长。aFGF在体外培养中可促进分化中的软骨细胞发生迁移和集落形成，促进离体的软骨细胞前质的分化、软骨细胞的增殖和成熟。向关节腔注射重组人酸性成纤维细胞生长因子可以较好地延缓兔膝骨关节炎软骨退行性变和预防骨关节炎的发展［21］。陈纪宁等［22］研究发现，向试验侧管内注入aFGF，2周后即在骨断端髓腔、骨内膜及皮质断面处有新骨形成，并长入管内血肿，8周后血肿已基本被骨组织代替，达到骨愈合，说明aFGF可有效促进大鼠引导性骨再生，增强其修复骨缺损的能力。这一作用是因为骨基质中的由成骨细胞分泌的aFGF具有有丝分裂活性，在骨损伤修复过程中，可刺激骨生成细胞增殖和毛细血管生成，促进骨再生。

2.6 其他功能

此外，aFGF还有摄食的调节、抗辐射、影响人体免疫系统、激素调控、细胞抗凋亡、细胞迁移、止疼和催眠等多种功能。

3 haFGF在基因工程方面的研究

haFGF作为人体内的微量活性物质，虽然在人体内分布很广但含量甚微，仅靠传统方法从体液或组织中提取，成本太高难以满足日益扩大的临床需求。自1982年重组人胰岛素作为世界上第一个基因工程产品问世以来，现代生物制药技术的开发应用有了突破进展，为aFGF的批量生产带来了希望，为多种疾病的治疗带来了福音。

1986年，Jaye等［23］首次从人脑中克隆了haFGF基因，并测定其核苷酸编码序列，证实aFGF缺乏经典的信号肽序列，自此aFGF的研究进入DNA重组阶段。1992年，Zazo等［24］首次在大肠杆菌中成功表达了完整形式的haFGF蛋白，此前没有通过基因工程在大肠杆菌中得到过全长154个氨基酸的aFGF。汪浩勇等［25］将编码haFGF的基因插入到质粒pBV220的EcoR I位点，获得了能够高效表达具有aFGF生物活性产物的工程菌株，表达产物约占菌体总蛋白的15%，主要以包涵体的形式存在，使国内首次解决了大量获得haFGF纯品的问题。

为了进一步提高重组haFGF的表达量、改善表达产物的生物活性及稳定性、扩大外源aFGF的来源，国内外学者已经成功在昆虫细胞、家蚕、酵母、哺乳动物和植物等多种不同表达系统中实现了表达。

1990年，Cao等［26］通过核型多角体杆状病毒感染，实现了haFGF在草地贪夜蛾Sf9细胞中的过表达。由于haFGF缺少经典的N末端信号肽序列，从细胞中释放出来的效率非常低。重组蛋白的表达产物约为10-20 pg每个细胞，感染48 h和72 h后培养基中只含有总蛋白产量0.5%和1.3%，这进一步证明了aFGF不能通过正常的跨膜途径分泌到胞外或是直接通过质膜。2001年，Wu等［27］用携带人酸性成纤维细胞生长因子cDNA的重组杆状病毒感染家蚕幼虫，通过组织分布分析，表达产物主要位于家蚕的脂肪体中，在注射约80 h后，重组aFGF表达量达到最大值，表达水平高达600-700 μg每只幼虫。杆状病毒表达系统能够提供一个强的多角体启动子和对重组蛋白进行翻译后修饰，研究证实其是一个有效且用途广泛的真核表达工具。2007年，Fantoni等［28］分别构建了haFGF的毕赤酵母胞内型和分泌型表达载体，并使一端带上His6标签。转化后得到的4种酵母菌株经过摇瓶培养均有蛋白产物产生，其中以胞内型haFGF重组蛋白的表达量最高，菌株经发酵罐扩大培养后每升培养物可达到108 mg，相当于0.68 mg/g湿细胞，是以往报道的全长haFGF产量的30倍，实现了具有生物活性的haFGF的大量生产。2011年，Zhou等［29］构建了aFGF乳腺特异性表达载体，并在人乳腺癌细胞MCF-7中实现了成功表达，这项研究使将转基因牛作为乳腺生物反应器成为可能。由于动物乳腺作为生物反应器生产的重组蛋白能够进行正确的翻译后修饰，且牛奶作为重组蛋白分离纯化的原材料具有安全、充足、容易获得等优点，动物乳腺生物反应器成为人们公认的商业上可行的生产重组蛋白的有效途径。2011年，Fan等［30］利用农杆菌介导的真空渗透瞬时表达体系，将haFGF基因导入豌豆基因组中，目的蛋白获得了成功表达并检测到了活性，在12-15 d内就能得到重组haFGF产物。用植物表达外源蛋白有许多优势，如能够正确进行折叠和翻译后的修饰，操作简单、产品安全，成本低廉、易于大规模生产等，并且无动物细胞的病毒和病原菌对人造成伤害的危险［31］。因此用植物生物反应器生产haFGF具有广泛的应用前景。haFGF已经先后在多种不同的重组表达体系中实现成功表达，尽管获得有生物活性的重组haFGF蛋白的难度很大，人们经过对高效表达体系的探索和分离纯化方法的改进，成功获得了与天然haFGF活性接近的重组haFGF，并且使重组蛋白表达量不断增加。对于aFGF的药用研究，国外仅在实验室阶段；我国于2001年批准了与aFGF相关的两项国家专利，并批准了暨南大学医药中心研究的由大肠杆菌生产的重组haFGF作为一种外用创伤药物（艾夫吉夫）进入临床试验阶段。aFGF已经成为我国具有独立知识产权的一类基因工程新药［32］。

4 aFGF应用于临床需注意的问题

aFGF在皮肤的损伤修复过程中发挥重要作用，被广泛应用于烧烫伤、溃疡、移植等多种皮肤损伤的修复。李校堃等［33］对皮肤用药的药代动力学研究证明，重组的haFGF不能透过正常皮肤进入体内，皮肤受损后，可通过破损表皮进入血液循环，但吸收量很少，由于haFGF的半衰期较短，用药3 h后血液中的含量便基本消失，因此在体内无蓄积作用；吸收后rhaFGF对皮肤有较大的亲和力可向其他皮肤扩散，且远处皮肤含量较高。临床上皮肤损伤形成的微环境多成酸性，aFGF的等电点是5-7，在酸性条件下呈现出较好的稳定性和生物学活性。许华等［34］对皮肤用药的长期毒性研究证实，rhaFGF在有效剂量的15倍以下进行皮肤用药是安全的。

aFGF广泛的生物学活性使其可以用于多种疾病的治疗，但其强大的光谱的促有丝分裂活性在临床使用中会引发正常组织增生甚至癌变等多种意料之外的严重后果，极大的限制了aFGF的广泛应用［35］。因此，将aFGF用于临床治疗时，使用的时机、剂量、途径和部位等都应受到严格控制。此外，虽然我国对aFGF用于多种疾病的治疗研究已经取得了很大进展，但要使其广泛的应用于临床，还需要经过长期的临床试验观察和全面的安全性评价［36］。

5 aFGF的改构体

为了使aFGF得到广泛的应用，避免其广谱的丝裂原活性在临床应用中带来的副作用，国内外学者进行了大量的研究。haFGF基因N端27个氨基酸对丝裂原活性十分重要，将该序列去除得到的非促分裂haFGF（nonmitogenic haFGF，nhaFGF） 改构体，丧失了诱导细胞分裂等促有丝分裂活性，但仍保持着原有aFGF的舒张血管、神经调节、心肌保护和局部缺血保护等作用［37］。翁立新等［16］利用改构型aFGF和野生型aFGF治疗肠缺血再灌注损伤后大鼠，结果表明两种aFGF对肠缺血再灌注损伤后的肝、肾功能均有保护作用，且无明显差异。目前，aFGF改构体的部分药效已经得到证实，更多的保护机制正在探求中，改构体去除了丝裂原活性，减少了人们对体内用药安全性的担忧，对aFGF的广泛应用具有重要意义。

6 展望

aFGF具有广泛的生物学效应，在临床上有重要的作用，既可用于治疗烧烫伤、溃疡、切口等创面愈合，又可治疗机体缺血损伤、心脑血管疾病、神经系统疾病、骨骼修复及眼晶状体再生等多种疾病，越来越受到人们的重视。nhaFGF改构体的研究大大拓宽了aFGF的应用范围，使aFGF更加广泛地应用于临床。aFGF广泛的临床应用价值使其与其他多种药物相比展现出独特的优势，但由于受到活体试验和伦理学的限制，人们对aFGF多种活性的作用机制并不是十分清楚，还需要研究者通过大量的动物试验作进一步完善。今后还应继续对aFGF的结构组成、功能活性和信号转导等基础领域进行深入研究，为aFGF的实际应用提供理论基础和试验依据，以期在临床应用中使aFGF的作用得到更大的发挥，使aFGF具有更为广阔的应用前景。

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