RNA干扰介导的抗HIV治疗研究进展

杨文思 王沂 王洋

（1.河北大学生命科学学院，保定 071000 ；2.河北联合大学附属医院，唐山 063000；3.河北联合大学生命科学学院，唐山 063000）

RNA干扰（RNA interference，RNAi）现象是指内源性或外源性双链RNA（double strands RNA，dsRNA）与细胞内的同源序列mRNA相结合并使之降解的现象，是一种序列特异转录后的基因沉默机制，其作用相当于基因敲除。同传统的基因敲除技术相比，RNAi技术具有高效、特异、操作简单及设备依赖性低的优点，已经成为生物学实验室中一种强大的实验工具。目前，实验中常用的RNAi手段主要包括直接转染小或短干扰RNA（small/short interfering RNA，siRNA）以及转染携带小或短发卡RNA（small/short hairpin RNA，shRNA）的质粒。其中，siRNA是一类20多个核苷酸长度的双链RNA分子，可以通过化学方法直接在体外合成，也可以体外转录合成或者由长片段dsRNA体外经RNaseIII类酶降解后产生，然后通过转染的方法导入细胞，作用时间相对较短。而shRNA是一段具有紧密发卡环（tight hairpin turn）的RNA序列，首先将其编码DNA克隆到专门的表达载体中，通过载体导入细胞，在细胞中，shRNA被加工成siRNA，发挥抑制特异mRNA表达的作用。这种装载了shRNA的载体可以通过筛选稳定传递到子代细胞中去，从而使基因的沉默可被遗传，因而作用时间更加长久稳定［1］。自RNAi技术问世并成熟以来，因其高效、安全、作用特异的优点很快就成为生物医学领域所关注的对象。目前，RNAi疗法已经在包括肿瘤、炎症、遗传病、抗病毒及代谢性疾病等多个领域展现了良好的应用前景，其中部分已经进入了临床实验阶段。

人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）属于反转录病毒科，慢病毒属，其基因组由两条相同的正链RNA构成，感染靶细胞后能够逆转录为DNA并整合到宿主细胞基因组中，随宿主细胞的基因复制并表达，是引起人类获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）的病原体。随着医疗水平的进步，艾滋病已经成为一种可控的慢性传染病。目前，高效抗逆转录病毒治疗（HAART）是艾滋病的最根本的治疗方法。但该方法只能控制病毒感染，降低死亡率和并发症的发生率，并不能完全治愈AIDS，患者需要终生服药，昂贵的治疗费用令普通患者难以承担。因此，AIDS的治疗仍是医学界的一大难题。RNAi技术为AIDS的治疗提供了新的手段，世界各地的多个研究小组致力于通过RNAi技术治疗AIDS，并且已经取得了初步的成果。本文是就RNAi抗HIV治疗的研究进展所作综述。

1 抗HIV RNAi治疗靶点的选择

RNAi治疗最关键的一点就是寻找合适的靶点。一般来说，抗HIV RNAi治疗的靶点可以是HIV基因组本身，也可以是编码HIV复制或感染关键蛋白的、宿主细胞来源的mRNA。到目前为止，几乎所有的HIV编码和调控基因都已经被用作抗HIV RNAi治疗的靶点并在体外实验中加以验证。其中效果比较好的包括tat、rev基因等［2］。来自宿主的RNAi靶点，目前已经通过实验证明有效的包括NF-κB、CD4、趋化因子受体CCR5和CXCR4等，其中NF-κB是激活HIV-1基因表达的主要转录因子，而CD4、CCR5和CXCR4是HIV-1入侵靶细胞的主要受体，抑制这些分子的表达可以有效的抑制病毒复制和病毒感染过程［3，4］。

HIV病毒可以产生针对抗HIV RNAi的抵抗能力。产生这种抵抗现象的原因主要包括：（1）RNAi作用的靶RNA发生单一点突变；（2）靶点附近发生突变导致作用靶RNA空间结构改变；（3）靶RNA发生缺失突变［5］。这些突变均可引起siRNA与靶RNA亲和力降低甚至缺失，产生特异siRNA抵抗的病毒株。因而，采用单一siRNA很难达到长期抑制HIV复制的效果，为了解决此问题，一方面应该尽量选择病毒基因组中保守性比较强的序列作为RNAi的靶点；另一方面，可以选择宿主细胞中对病毒复制起关键作用基因的转录本作为RNAi的靶点，因为宿主细胞的编码基因极少会发生突变，因此也能减少逃逸突变发生的几率；再者，解决此问题最好的方法是将多种针对不同靶点的siRNA组合应用，从多个角度抑制病毒的复制、感染等过程［6，7］。此外，最近还发现，HIV存在一种交叉抵抗机制，即HIV对某一种siRNA突变产生逃逸的同时，可以对另一种针对不同靶点的siRNA产生逃逸，此两种siRNA的靶点可能相距几千个碱基，但其产生的具体机制仍然未知［8］。这一发现为RNAi抗HIV治疗靶点的选择提出了更高的要求。

鉴于宿主细胞基因产物在抗HIV RNAi治疗中不易产生突变逃逸的优点，目前，抗HIV新靶点的开发主要集中在人类病毒复制相关基因上。近年来，世界各地的多个研究团队通过全基因组RNAi技术对人类基因组进行筛选，各团队在实验设计和研究角度上略有不同，导致鉴定出的结果不尽相同。自2008年以来，累计鉴定出了上千个与HIV复制密切相关的宿主来源基因，首次发现其中很大一部分基因与HIV的复制相关，这些研究为抗HIV的RNAi治疗提供了大量可能的靶点，有些靶点已经被用于实验性抗HIV治疗，并取得了比较好的效果［9-17］。

2 抗HIV RNAi治疗的手段

目前，RNAi介导的抗HIV治疗主要包括不需要载体的siRNA治疗以及载体介导的shRNA治疗。

2.1 SiRNA介导的靶向抗HIV治疗

SiRNA用于体内抗HIV治疗所面临的最大难点是缺乏有效的siRNA体内传递机制，这一瓶颈严重限制了其在临床上的应用。siRNA的生物学本质决定了其极不稳定、很容易被核酸酶降解，同时容易引发宿主的免疫反应，不易透过细胞膜，因而直接注射到血液中几乎完全不能发挥作用。因此，探索一种将siRNA通过血液循环高效准确的输送进入靶细胞的转运机制成为了RNAi技术应用于临床函待解决的关键问题，同时也是最具挑战性的问题。目前，已经有多种能够保护siRNA在血液中不被短期内降解的方法被报道。例如，将siRNA进行化学修饰、构建包含siRNA的纳米颗粒等。但血液中细胞成分多种多样，注射入血液的siRNA即使不被降解，也很有可能被血管内皮细胞、中性粒细胞和红细胞等非靶细胞吸收而失去效应。并且在实践中，HIV的靶细胞——T细胞、巨噬细胞和树突细胞对于siRNA来说都是难以被转染的细胞。针对这一问题，最近的一些研究均采用了靶向传递方法并取得了较好的效果。

2.1.1 抗体介导的siRNA靶向治疗 一直以来，抗体都是介导靶向治疗最经典、最有效的媒介物。目前，已在实验中用于介导RNAi治疗的抗体包括抗CD7、gp120和LFA-1抗体等。一般来说，与抗原结合后能够发生内化的抗体是靶向RNAi治疗的最佳选择，在siRNA和内化抗体的嵌合体中，抗体既能起到靶向作用又能介导siRNA进入靶细胞。但能够介导内化的抗体并不容易制备，研究者常常通过一些基因工程或者化学修饰的方法实现抗体介导的内化，目前常用的方法包括穿透肽导入法及免疫脂质体法。穿透肽通常是一段富含碱性氨基酸残基的短肽，与抗体相连后能够介导抗体内化。Kumar等［18］将CD7单链抗体与9个精氨酸残基构成的穿透肽相连成为内化抗体，将此融合抗体与针对HIV-1 vif、tat基因以及针对宿主细胞CCR5基因的siRNA相连后注射入人源化HIV-1病毒血症的小鼠体内，结果有效的抑制了内源性病毒的复制并且重新恢复了CD4+T细胞数量。HIV-1 gp120糖蛋白位于病毒外壳表面以及被感染的细胞表面，因而可以用作区分HIV-1感染的细胞和正常细胞的标志，非常适于作为抗HIV-1靶向治疗的靶点。Song等［19］将gp120抗体重链与天然穿透肽——鱼精蛋白偶联成为内化抗体。将该内化抗体与针对宿主基因的siRNA连接后静脉注射小鼠，检测各种细胞中siRNA目的基因的表达水平，结果显示，仅gp120表达细胞中目的基因的表达被抑制，而其它细胞未受影响。将gp120内化抗体与针对HIV-1 gag基因的siRNA偶联后，可以抑制难以转染的HIV-1感染T细胞中病毒的复制。

免疫脂质体是将单克隆抗体或基因工程抗体共价结合在脂质体表面，由抗体携带脂质体到靶细胞表面，脂质体通过细胞吞噬、融合等方式进入靶细胞并释放内容物。该种方法的优点在于实现靶向内化的同时借助脂质体保护了内容物不被降解，后一优点对于脆弱的siRNA尤为关键。淋巴细胞功能抗原-1（LFA-1）为整合素家族蛋白，该蛋白特异性的高表达在所有白细胞表面，包括T细胞、巨噬细胞和树突细胞，这些细胞在HIV感染和致病过程中发挥着重要的作用。这一特点使LFA-1抗体成为传递siRNA到血液系统靶细胞的理想载体。Kim等［20］将LFA-1靶向的免疫脂质体包裹CCR5 siRNA成为纳米颗粒，注射病毒血症的人源化小鼠能够有效地抑制病毒的扩增以及感染造成的CD4+T细胞减少。

2.1.2 适体（aptamer）介导的siRNA靶向治疗 适体是具有独特的二级和三级结构，能与有机化合物或蛋白质等配体专一和高效结合的RNA或DNA片段。利用适体的这种特性，可以介导siRNA的细胞特异性传递。适体和siRNA的共价嵌合体可以通过体外转录的方式非常方便的大规模生产。Neff等［21］将能够与HIV包膜蛋白gp120特异结合的适体RNA和抗HIV-1 siRNA结合。对这种适体RNA进行2’氟化修饰后能够与HIV-1 gp120蛋白发生特异性结合并引起内化。Zhou等［22］将针对gp120的适体蛋白进行了优化，使其成为一种双功能适体RNA，一方面可以作为载体运输siRNA到靶细胞；另一方面适体本身与HIV-1表面gp120结合后阻断HIV-1的感染作用。将gp120适体-siRNA嵌合体每周一次、连续几周注射HIV-1病毒血症的小鼠，HIV-1病毒载量明显下降。

CD4是HIV进入宿主T细胞的最重要的受体途径。CD4适体可以阻断HIV-1与CD4分子的作用。CD4适体-siRNA嵌合体RNA被特异性地用来向CD4+细胞运输siRNA，可以在体外以及宫颈组织移植物中抑制目的基因的表达。该适体-siRNA嵌合体被血管内注射用于人源化小鼠模型时，其携带的针对HIV gag和vif或宿主CCR5的siRNA能够有效地防止病毒传播到宫颈移植物［23］。

截止目前，至少在人源化小鼠中，细胞特异性siRNA运输用于治疗HIV-1感染取得了很好的效果。下一步非人灵长动物的实验将进一步验证其安全性和效率。

2.2 shRNA介导的基因治疗

一名伴有AIDS的白血病患者在接受了一次造血干细胞移植后，却意外的治愈了AIDS，HIV-1感染被完全清除，原因在于这名供者的造血干细胞是细胞因子受体CCR5缺失的纯合子，移植进患者的干细胞由于缺乏HIV-1感染所需的共受体CCR5而不能被HIV-1感染［24］。这个病例虽然仅是一个个例，却为AIDS的治疗提供了新的思路，即通过重建造血系统抵抗HIV-1的感染。但是CCR5-/-且配型合适的供者并不容易获得，从而严重限制了这一治疗方法的应用。因此，有必要研究一种机制类似的、可操作性更强的抗HIV疗法。采用自体干细胞在体外基因修饰后重新输回体内重建造血不失为一种很有前途的治疗AIDS的替代方法。shRNA具有可以整合到宿主细胞基因组、稳定表达、作用时间持久的优点，被看作此种治疗最有效的手段，而慢病毒载体则被视为介导shRNA整合入宿主细胞基因组的最佳媒介。慢病毒载体最大的优点是可以感染非分裂期的造血干细胞，并且高效的整合到细胞的基因组中，稳定传递到子细胞中并长期表达，产生持久的治疗效果。慢病毒载体介导shRNA治疗的另一个优点是可以将多个针对不同靶点的shRNA或者抑制HIV复制的其它元件构建在一株慢病毒载体中，通过一次稳定感染，达到多重抑制的效果，从而有效、方便的避免了治疗逃逸现象的发生。

Li等［25］将包括tat/rev shRNA、针对CCR5的锤头状核酶以及核仁内反式激活反应元件类似物（nucleolar-localizing TAR decoy：抑制TAR元件与DNA的结合）在内的3种抗HIV-1元件串联排列构建入慢病毒载体，重组慢病毒体外感染造血干细胞后自体回输入4名感染HIV-1的血液病患者体内。结果显示，整合了3种抗HIV-1元件的造血干细胞可以分化成各种系列的血细胞，移植后24个月仍可在外周血各系血细胞中检测到siRNA和核酶的表达。Walker［26］构建了一株包含CCR5 shRNA、人类/猕猴TRIM5α基因和核仁内反式激活反应元件类似物的慢病毒载体，感染了该重组慢病毒的CD34+造血干细胞在人源化免疫缺陷小鼠体内可以分化为HIV-1抗性的CD4+T细胞。髓系来源的HIV-1靶细胞，包括巨噬细胞和树突细胞，常常作为HIV-1的细胞储存库，但这两种细胞对重组慢病毒感染具有极强的抗性，对慢病毒介导的shRNA治疗不敏感。Bobadilla等［27］将一段猴免疾缺陷病毒（SIV）/HIV-2来源的Vpx蛋白编码序列引入慢病毒载体，该蛋白能够增强病毒cDNA向细胞核的转位和基因组整合，显著提高了慢病毒载体对巨噬细胞和树突细胞的感染能力。这些实验的成功充分证实了以shRNA为基础的细胞疗法治疗AIDS的可行性和有效性。

MicroRNA （miRNA） 是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA 分子，在分子特征、生物合成和作用机理上与siRNA非常相近，可以看作是内源siRNA。多种功能相关的miRNA编码基因常在基因组上成簇排列，受RNA聚合酶Ⅱ型启动子调控而表达。受此启发，一些研究者将shRNA、核酶等HIV-1抑制元件的编码序列取代某一miRNA基因簇上miRNA编码基因，或者直接模仿miRNA基因簇构建包含上述RNA元件编码序列的人工多顺反子，然后通过慢病毒介导整合靶细胞，使靶细胞可以长时间有效抵抗HIV-1感染而不影响靶细胞的生物学性状［28，29］。由于采用了更加高效且种类繁多的RNA聚合酶Ⅱ型启动子，因而通过选择合适的启动子可以实现siRNA的可控和组织特异性表达。

除慢病毒载体外，泡沫病毒也被用于实验性抗HIV shRNA治疗。Kiem等［30］将tat/rev shRNA与膜结合HIV-1融合抑制肽C46编码序列串联构建入泡沫病毒载体，感染了该重组泡沫病毒的人类CD34+细胞在免疫缺陷小鼠体内得到了充分的扩增，为泡沫病毒介导HIV-1 shRNA治疗的可行性提供了依据。

3 其他

除了siRNA导入靶细胞手段的研究外，一些研究团队旨在通过生物信息学方法对抗HIV siRNA以及shRNA的设计进行优化，以期提高抑制效率，减少细胞毒性。Low 等［31］通过高分辨率引物延伸选择性2’羟基酰化分析法（selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension，SHAPE），对已知的HIV-1 RNA的分子内结构进行分析发现，RNAi抑制效率与靶RNA热力学特点的关系。依照该关系设计的shRNA比普通设计的shRNA抑制效率更高且几乎没有细胞毒性。

Tyagi等［32］总结了所有抗HIV RNAi研究的结果，构建了一个名为HIVsirDB的免费数据库，该数据库收录了目前实验验证可以沉默HIV基因的所有siRNA，详细介绍了每个siRNA的序列、靶RNA位点、针对HIV病毒株、抑制效率以及序列保守性等信息，这一数据库的开发为今后HIV的RNAi治疗提供了重要的借鉴。

4 小结

RNAi介导抗HIV治疗在体外和体内实验中取得了一定成果，并显示出了良好的前景，但距离真正应用于临床可能还需要很长一段时间。一些重要的技术问题仍然亟待解决，如最佳RNAi靶点的确立，如何将siRNA有效、特异的导入HIV感染细胞、如何进一步延长shRNA在血细胞中表达时间及病毒载体导入安全性等。但随着RNAi相关技术手段的不断进步，对HIV致病生存机制更深刻理解，RNAi介导的抗HIV治疗将会成为AIDS治疗中的一个极为重要的手段。

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