全自动微生物定量分析仪在食品检测中的应用

于晓婕，孙秋影，李蓉娟，陈晓东，李雪梅，施东福，于杰，*

（1.四川大学生命科学学院，四川成都 610065；2.国家农兽药残留及海洋生物毒素检测重点实验室，辽宁东港 118300；3.辽宁丹东出入境检验检疫局，辽宁丹东 118000）

全自动微生物定量分析仪在食品检测中的应用

于晓婕1，孙秋影2，李蓉娟2，陈晓东3，李雪梅2，施东福2，于杰2，*

（1.四川大学生命科学学院，四川成都 610065；2.国家农兽药残留及海洋生物毒素检测重点实验室，辽宁东港 118300；3.辽宁丹东出入境检验检疫局，辽宁丹东 118000）

摘 要：微生物污染引起的食源性疾病是世界食品安全最突出的问题之一，采取有效方法对食品微生物进行检测是非常必要的。主要对全自动微生物定量检测方法与传统的检测方法进行比对分析，并采用这两种方法对海产品及烘干鸡肉进行微生物检测，结果表明全自动微生物定量分析仪（TEMPO）检测的准确性和敏感性均较高，但也有其局限性。

关键词：微生物检测；食品安全；全自动微生物定量分析仪（TEMPO）

食品是人类赖以生存和发展的物质基础，近几年来，安全问题越来越受到人们的重视，微生物对食品的污染问题也相应的受到人们的关注。微生物在生产、运输、销售等各个环节都有可能污染食品，一旦污染，便会大量繁殖，导致食品腐败变质，引起食源性污染和食物中毒。而现在环境污染和生态破坏日益加剧，可导致人类感染和中毒的致病菌种类也越来越多。为了防止此类中毒事件的发生，采取适当有效的食品微生物检测方法，是避免和预防微生物食源性污染的重要手段。而传统的检测方法实验繁杂、耗时较长、工作繁重[1-2]。因此，人们开始研究食品微生物检验的新途径，寻找微生物检测的新载体，全自动微生物定量分析仪（TEMPO）就是在这种新思路下而产生的新型微生物检测仪，它是在建立MPN方法[3-5]的基础上，以16管的形式改良成一个单独的耗材、最小化的卡片，利用发生特应的酶反应检测相应的荧光信号来判读微生物的指标。

当前，现代科学技术蓬勃发展，而微生物检测技术也融合了生理学、生化学、免疫学、分子生物学和电子技术等多种学科[6]，不断创造检测的新方法，寻找新思路。传统的微生物检测需要大量的器皿、长时间的实验前准备工作和试验后消毒工作[7]，操作复杂，耗费时间长，而全自动微生物定量分析仪（TEMPO）操作简便易行，特定的试剂无需大量人力，批量操作省时省力。本文以海产品及烘干鸡肉的微生物检测为例，分别从菌落总数计数、大肠菌群计数、大肠杆菌计数、金黄色葡萄球菌计数以及肠杆菌科计数等检测项目上，对比国标方法与TEMPO，以此评价全自动微生物定量分析仪（TEMPO）的的优势和不足。

1 材料

1.1 样品

海产品及烘干鸡肉（宠物食品）：由国家农兽药残留及海洋生物毒素检测重点实验室样品收样室提供。

1.2 仪器及试剂

全自动微生物检测仪以及相应所使用的检测卡片与试剂由法国梅里埃公司生产；传统检验所用的培养基以及各种试剂均由OXOID公司所生产。各种试剂以及培养基均在有效期内使用。

2 检测方法与结果

2.1 菌落总数检测

菌落计数是用来监督产品的卫生质量并能提示产品是否新鲜或者已腐败的一项重要指标。同一样品进行取样、稀释、然后分别按照国标GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[8]和全自动微生物自动分析仪（TEMPO）进行检测。全自动微生物定量分析仪（TEMPO）对菌落总数的检测方法和NF EN ISO 4833[9]标准相当的性能水平。它是将样本接种到培养基，再通过TEMPO充填器传输到有3种不同规格的48孔卡片中。同时充填器也会密封卡片以此避免在随后的处理过程中带来的污染的风险。将国标法所做的平板连同卡片一同在培养箱内培养，卡片中存在的微生物分解培养基中的底物，并产生能被TEMPO读数器检测到的荧光信号。48 h后分别读取平板菌落数和卡片菌落数。全自动微生物定量分析仪（TEMPO）是依照MPN方法的原理，TEMPO系统根据阳性孔的大小和数目来推算出原始样本中的微生物总数。共检测432份水产品样品，通过与国标比对，其和平板计数的符合率为89%，对其不符合的样品进行多次重复的检测与分析研究，结果发现这些不符合样品全是酶活力较强的水生软体动物，这些酶活力较强的物品会影响底物的反应，从而导致全自动微生物定量分析仪（TEMPO）读取的荧光信号变化，试验中还发现高酶活可以降低对底物的这种影响。而同组其它样品检验效果均一致，由此而知，全自动微生物定量分析仪（TEMPO）可以用做批量菌落检测但是有其局限性。

2.2 大肠菌群计数检测

大肠菌群计数在食品质量监测方面十分有效。阳性结果可能预示着食品加工过程中或加工环境存在着问题。432份样品进行全自动微生物定量分析仪（TEMPO）和国标法GB 4789.3-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》[10]检测。TEMPO的大肠菌群计数检测有TC和CC两种方法，操作方法同样但是分别有两种不同的培养基试剂。TEMPO TC的开发是为了获得NF ISO 4832[11]标准相当性能水平。TEMPO CC法是TEMPO仪器上根据BAM[12]方法专门用于24 h计数食品中大肠菌群的方法。该方法是为了获得和AOACR官方方法966.24及美国公共健康联合会检测乳制品标准方法（SMEDP）一致的效果[13]。卡片由3套不同大小的16孔组成（小，中，大），每种类型孔的容量相差一个对数。培养基中含能发出被TEMPO读数器检测到信号的中性荧光底物。培养期间，如果卡片中存在大肠菌群则分解营养底物，pH下降，荧光信号减弱。依照MPN方法的原理，TEMPO系统根据阳性孔的大小和数目来推算出原始样本中的大肠菌群数。样品同时进行国家标准检测，432份样品通过其和传统的国标法检测结果进行对比，符合率为99%。说明全自动微生物定量分析仪（TEMPO）能够满足本实验室大肠菌群的检测，但由于本实验室样品局限性，可能并不能充分说明该法的使用范围及其影响因素，有待进一步研究。

2.3 大肠杆菌技术检测

大肠杆菌是人和动物的共同寄居菌。该种细菌大量繁殖可能会造成食物中毒。某些菌种被认为是致病性的并能产生一种或更多种的毒素。全自动微生物定量分析仪（TEMPO）所配套的试剂EC是专门用于24 h检测计数大肠杆菌的。该方法达到与ISO 16649-2：2001《食品和动物饲料的微生物学例举葡萄糖苷酸酶阳性大肠杆菌计数方法，第二部分：44℃温度下利用5溴-4氯-3吲哚-D-葡糖苷酸的菌落计数技术》[14]标准相当性能水平。培养期间，有大肠杆菌存在的卡片就会还原培养基中的底物并产生可被TEMPO读数器检测到的荧光信号。参照MPN方法，TEMPO系统根据阳性孔的数目和大小来推算出原始样本中的大肠杆菌数量。样品同时按照国家标准GB/T 4789.38-2008《食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数》[15]检测，两者结果进行对比，符合率为86%，准确度无差异并对不符合的样品经行多次重复检测，通过分析显示该法可以满足实验室批量检测的需要，但是对与高酶活性的样品不可适用，尤其是高酶活性的水生软体动物，并通过多次重复试验发现扩大稀释倍数可以降低高酶活的干扰。

2.4 金黄色葡萄球菌计数检测

金黄色葡萄球菌能够引起细菌性食物中毒，其对水产品的污染将严重影响到食品安全和水产品加工出口贸易。TEMPPO-STA是利用凝固酶的原理通过荧光值的判读来进行葡萄球菌的计数。崔岩，田卓等[16]利用TEMPO/STA法与PetrifilmTM测试片法两种方法对535个出口水产品进行了检测比较，结果发现两法一致性较好（符合率96.6%，准确度无差异）。本文通过国标GB 4789.10-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》[17]检测与TEMPPOSTA的检测进行比较，结果其符合率达到97%，准确度无差异，而TEMPO/STA法又具有操作简便，人为误差小的特点，故其将成为重要的检测手段。

2.5 肠杆菌科技术检测

肠杆菌科的细菌是食品工业的主要指标，因为其同时包括肠道致病菌和重要的食物腐败因子，因此被广泛地作为食品卫生和安全的指标。本实验室检验肠杆菌科的样品主要为烘干鸡肉（宠物食品）。全自动微生物定量分析仪（TEMPO）肠杆菌科检验所采用的卡片用于22 h～27 h（35±1）°C计数样品中肠杆菌的卡片，从而判断是否受污染。该卡片的开发是为了获得和EN ISO 21528-2标准相当的效果[18]。同样按照行标SN/T 0738-1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》[19]进行检测，两者结果对比，其符合度达到97%，准确度无差异。该法可以用做本实验室的批量试验要求，但由于其样品的局限性对其他样品的准确性不能确定，有待进一步研究。

3 讨论

全自动微生物定量分析仪（TEMPO）与国标方法相比，能够满足准确性的要求，省去了传统试验方法中繁琐而耗时的检测步骤，对于批量检测更为轻松[20]，实验过后的灭菌以及清理工作也变得非常简单。随着科技的进步，机器自动化代替手工是全世界各行业的一个趋势[21]，TEMPO方法是食品行业中第一个用于食品和环境样品的质量指标生物计数的自动化质量指标测试系统。自动化指标测试使得食品制造商只需有限的时间和资源用于技术条件不能检测的阳性测试样本的后续试验。指标测试通常寻找微生物，这些微生物是反映严重病原体存在的重要指标。相比那些非常耗时的细菌培养和平板计数读取，TEMPO通过自动化加快了这一耗时的过程，同时提供优质而一致的实验结果，并省去通过主观方式平板读数的过程，同时保持了样品从准备到最终报告完成的结果的可追溯性。

通过两种方法的比对分析我们不难发现，一些高酶活性样品以及颜色较重的样品均对结果产生影响。这说明TEMPO全自动微生物定量分析仪（TEMPO）的有一些局限性。一般情况下，高酶活性的样品会对细菌总数检测和大肠杆菌计数检测产生干扰，通过大量的实验证明，扩大稀释度，可以减弱这种干扰，但是却不能消除。通常含有发酵剂的食品、面粉、蛋糕、生面团、容易受到含有强抑制剂（例如香料、高盐分产品）或者深色产品（可可粉）等样品用TEMPO检测时候会受到干扰。

随着现代科技的发展，可以预料在不远的将来，传统的微生物检测技术将渐被各种新型简便的微生物快速诊断技术所取代。全自动微生物定量分析仪（TEMPO）具有广阔的前景。目前TEMPO检测的项目还比较局限，检测样品也有所区别，但是微生物检测计数一直在不断发展，不断在创新，TEMPO将成为未来重要的检测手段之一，有待于进一步开发利用。相信凭借着TEMPO检测仪的发展检测自动化时代即将到来。

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The Automatic Microorganism Quantitative Analyzer Apply in Test of Food Microorganism

YU Xiao-jie1，SUN Qiu-ying2，LI Rong-juan2，CHEN Xiao-dong3，LI Xue-mei2，SHI Dong-fu2，YU Jie2，*
（1.College of Life Science，Sichuan University，Chengdu 610065，Sichuan，China；2.National Key Laboratory of Pesticid and Veterinary Drug Residue and Marine biotonix Detection，Donggang 118300，Liaoning，China；3.Dan dong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dandong 118000，Liaoning，China）

Abstract：Foodborne disease caused by Microbial pollution is one of the most outstanding issues of the world's food safety，take effective methods for food microorganism detection is necessary.This paper introduced the difference of the automatic microbiological quantitative detection method and the traditional detection method，and the use of two methods on seafood and dried chicken to test microorganisms，the results showed that automatic microorganism quantitative analyzer（TEMPO）test accuracy and sensitivity was higher，but it had its limitations.

Key words：the test of microorganisms；food safety；the automatic microorganism quantitative analyzer（TEMPO）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.001

国家质检总局科研项目（2008IK001）

于晓婕（1991—），女（汉），学士，主要从事微生物研究。

于杰（1963—），男（汉），学士，主要从事食品微生物检验工作。

2012-10-10