储粮微生物危害检测技术研究进展

张燕燕 蔡静平 蒋 澎

ZHANG Yan－yanCAI Jing－pingJIANG Peng

（河南工业大学生物工程学院，河南 郑州 450001）

粮食储藏过程中的品质易受到气候、季节等自然因素和粮食品种、入库水分等自身因素的影响。若要提高粮食的储藏效果，保持粮食的食用品质，需要对粮食储藏过程中的各种变化进行实时监测，保证储粮安全。粮食中除了淀粉、脂肪、蛋白质等基本营养物质组成外，还含有各种维生素、微量元素等多种天然有机物质，是各种微生物生命活动中较为理想的天然营养基质，在合适的温度和湿度条件下，它们的生长、繁殖会引起粮食的品质劣变。尤其是微生物中的霉菌，其生长繁殖能力强，可直接或间接的利用粮食中的各种营养物质，分泌多种水解酶（淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶）将粮食转化为自身所需的小分子营养成分，进行代谢活动，使粮食的各种品质指标和加工工艺指标发生变化，严重影响粮食的价值，有些霉菌，例如黄曲霉菌（Aspergillusflavus）会产生剧毒的黄曲霉毒素进一步危害人畜健康［1］。因此，对储粮过程中霉菌活动的监测是保障储粮安全性的关键环节。

传统的霉菌培养检测方法虽然可以为储粮的安全性提供一定的指示，但是其检测操作技术专业性强、要求高、操作程序繁琐、检测工作量大、时间长，难以满足储粮经常性监测的需要。另外，粮食中的许多霉菌生长速率和营养要求的差异性大，使一些本来在储粮环境中不能进行生长和代谢活动的霉菌孢子萌发和迅速生长，给带菌量的检测结果带来干扰。例如，常见的根霉 （Rhizopus）和毛霉（Mucor）等霉菌在大多数粮食储藏条件下是不能生长的，但在人为培养的适宜水分和温度条件下却会以远超曲霉的速度生长。实际储粮中初期的危害霉菌通常为灰绿曲霉（Aspergillus glaucus）和青霉（Penicillium），随着水分的增高，黄曲霉和其他曲霉逐渐变为优势曲霉［2］。但是在平板菌落培养技术中检测到这种变化不明显，使检测结果不能准确反映储粮环境中正常生长霉菌的类群，影响人们对粮情的判断。此外，霉菌的生长周期需要7d左右，检测结果不能与实际粮情变化同步，表现出滞后性［3］。

近年来，在食品行业应用较多的分子生物学微生物检测技术也被用来检测储粮霉菌，如DNA探针技术、PCR技术、基因芯片技术等［4］，这些技术虽具有较高的灵敏度和检测准确性，但操作程序复杂，对操作人员技术程度要求高、检测费用昂贵，在储粮监测中的应用受到限制。利用霉菌生物学特性对储粮安全的监测已经有较多的研究和应用，可以满足不同粮食和储藏特点的需求。文章主要阐述利用微生物生物学特性监测储粮安全的研究进展。

1 粮温检测技术

粮食储藏过程中出现霉菌生长时，由霉菌呼吸释放出的热量将大大超过粮食自身呼吸所释放的热量，由于粮堆是热的不良导体，造成热量在粮堆中积累，使粮堆温度升高，借助粮堆温度检测的方法可以快捷地发现储粮的异常状态［5］，这是粮温检测技术在储粮中应用的基础。从1998年起，中国对大型储备粮库开始进行重点建设，粮仓仓容、结构、设施以及管理手段都上了一个新台阶，粮温检测技术被进一步推广和普及，成为储备粮库中标配的储粮工艺之一［6］。

粮温检测技术由最初的温度计检测发展到电子传感器检测，并随着电子传感、计算机和网络技术的不断创新而快速发展。早期的测温传感器通过测量粮堆内部生命体代谢所释放出的热量，经过信号转导系统最终将数字显示在测温表上。随着电子技术的发展，由传统的热敏电阻、PN结温度、热电偶传感器向集成化温度传感器方向发展［7］。集成化温度传感器是将热敏原件、信号处理和校正等各种辅助电路集成在一起的半导体集成电路型温度传感器［8］，具有检测灵敏度高、线性好、不需要任何温度参考点等优点，不仅简化了传统的电路设计工序，还提高了测量精度，从而被迅速地普及和推广。

在实仓储藏中，考虑到成本等因素，中国大型粮仓主要使用的是数字化温度传感器［9］，可以实现自动巡回检测，并开发出了无线检测系统，简化了复杂的布线工序，将无线测温传感器插入到粮堆的不同位置，可对粮堆中不同横向距离和深度进行立体检测，通过计算机平台的控制可以准确定位到粮堆的不同位置采集数据，实现全方位、立体化监控，若有异常，可立即采取措施。虽然粮温检测是目前中国大型粮仓采用的主要粮情监测方法，但是随着对储粮安全要求的提高，该方法有些缺陷也逐渐显现出来。首先，粮温检测仍具有滞后性，大量实仓储藏研究［10］表明，测温系统显示温度异常时，粮食往往已经发生霉变、变色、变味甚至出现结块。其次，在粮食早期霉变过程中，霉菌释放的热量较少且粮堆表面所产生的热量容易散失，会给测量结果造成干扰，不易做到粮食霉变早期的监测。所以，除了继续研究和开发测温传感器以提高粮温检测灵敏度和准确度外，还应该利用储粮霉菌代谢活动的其他特性研发储粮安全监测的方法。

2 CO2气体检测技术

粮食呼吸和霉菌呼吸均能产生CO2气体，如果温度和水分达到适合霉菌生长的情况，那么霉菌的呼吸强度远远大于粮食自身的呼吸强度，霉菌呼吸作用释放CO2气体的量也远大于粮食自身呼吸释放CO2气体的量［11］。依据霉菌呼吸产生CO2气体这一生理特性，已研发出多种CO2气体传感器。一般的检测原理是利用微型真空泵采集粮堆气体，通过流量计的控制将气体输送到CO2气体传感器进行测量，数值最终在显示屏幕中读取，依据CO2气体含量的变化监测储粮霉菌的活动状态，以及时采取措施保证粮食安全。CO2气体检测技术用于监测储粮安全的实验室研究已经较为深入。梁微等［12］进行了不同水分含量小麦模拟储藏中CO2气体含量变化与小麦带菌量相关性的研究，证明随着小麦水分含量的增加，检测的CO2气体含量随着小麦储藏天数的增加逐渐上升，超过安全水分的小麦检测到的CO2气体浓度与带菌量变化的相关性系数达到0.95以上，说明CO2气体检测法可以用来指示储粮中微生物的活动状态。耿旭等［13］研究了不同霉菌活动生理状态下CO2气体浓度的变化规律，霉菌从孢子萌发、菌丝生长到子代分生孢子形成的阶段CO2气体浓度随时间的变化呈“S”型曲线；霉菌在代谢旺盛期即菌丝生长阶段由于代谢速度加快，释放出的CO2含量增多，是霉菌开始大量生长的信号。由此可见，CO2气体检测技术的灵敏度更高，可比带菌量检测更早、更精确地反映储粮微生物危害情况，与粮温检测相比，CO2气体检测可以提高粮食早期霉变监测的准确率。

对实仓粮食储藏安全的CO2气体监测技术目前尚处于试验阶段，程树峰等［14，15］利用便携式CO2气体检测仪对实仓储藏小麦、稻谷的表面进行霉菌生长的检测，结果表明，实仓中安全水分以下的小麦或稻谷检测到的CO2气体浓度未见明显异常，而临界水分或偏高水分条件下可以明显检测到CO2气体浓度的升高，粮食开始霉变，实仓中易受潮湿的部位CO2气体的浓度明显上升。Maier等［11］利用CO2气体传感器对实仓中的粮食进行数年的安全检测研究，分别在粮仓顶端、仓壁、通风口等处设置CO2气体传感器，通过对CO2气体浓度的检测证明了实仓中CO2气体检测法要比电子测温法更灵敏、更准确的判定粮食霉变的程度和位置，根据CO2气体传感器的读数总结出粮食发霉程度的规律，CO2气体体积分数占环境气体的0.04%～0.05%以内均可视为安全储藏。王智等［16］通过对模拟粮仓预设霉变点探索了稻谷储藏期间CO2气体扩散规律的研究，CO2气体向水平方向扩散具有沉降性，在粮堆中下层设置气体检测点检测CO2气体浓度更能准确反应出实时粮情，通过对CO2气体扩散规律的研究进一步提高了储粮霉菌早期活动的检测效率。

在实仓储粮中应用CO2气体检测技术具有快速、灵敏、准确、成本低等检测特点，但是，由于粮食储藏的仓型不同，粮食自身品质差异较大，储藏过程中还有昆虫等产生CO2气体生物的影响，加上不同环境温湿度将影响CO2气体的扩散特性，因此，不能只依靠CO2气体检测数据的变化简单定义粮食的发霉情况，需结合其他快速检测手段进行综合判断。在敞口储藏的粮堆CO2气体检测中，还需考虑CO2气体释放对检测结果的影响。

3 电子鼻检测技术

电子鼻检测技术于1982年由Warwick大学的Persand和Dodd提出［17］，是一类通过模仿哺乳动物嗅觉来对环境中气味进行鉴别的装置，现主要应用领域是食品卫生行业，并向食品生产的在线监测研究方向发展［18］。其在粮食领域中的应用目前仍处于实验室的探索阶段。在粮食仓储行业，电子鼻的研究方向主要针对粮食新陈度的检验、储粮害虫以及储粮霉菌的检测。

如何在粮食开始霉变初期及时预测是将电子鼻技术引进粮食储藏行业中的主要目的。N.Magan等［19］研究发现霉菌利用粮食有机物生长繁殖的过程会生成许多中间代谢产物，且随着储藏时间的不同，发霉粮食所散发的挥发性物质浓度呈明显升高趋势。Linton等［20］对储藏的小麦、玉米、高粱中挥发物进行气质色谱联用的分析表明，挥发物由醇类、醛类、酮类、酯类等组成，微量时不易被人们察觉，当积累到一定量散发出刺鼻的气味时，粮食几乎丧失了储藏价值，而电子鼻可以利用自身的气敏传感器阵列、信号预处理单元和模式识别系统灵敏地分析气体成分，可以在产生气体初期及时预警，避免上述情况的发生。N.Magan等［21］通过对常见储粮霉菌中间代谢挥发物的测定也印证了上述结论。

自1997年Jonsson等［22］通过参考电子鼻在白酒、香水、烟草等方面的应用提出电子鼻也可以应用到谷物安全检测之后，围绕储粮霉菌早期检测的研究取得了一些研究进展，主要涉及电子鼻装置的更新及应用。在装置研发方面，主要提升气敏传感器的灵敏度，采用的方法是相对法、差分法、对数法和归一法［23］，为了进一步提高准确性，采用统计模式识别技术、人工神经网络技术和进化神经网络技术对输入的信号进行进一步处理［24］。邹小波等［25］使用8只传感器阵列组合对响应阵列进行径向基函数（RBF）神经网络分析，对霉变粮食的判定率达到90%以上。潘天虹等［26］利用厚膜金属氧化锡气体传感器阵列结合RBF神经网络系统对传感器模式识别处理系统进行优化，提高了电子鼻系统判定谷物霉变的准确率。伟力国等［27］研制的电子鼻能够快速对小麦霉变进行识别，该电子鼻检测系统由5只同系列不同型号的气敏传感器组成，每个传感器提取4个特征值，采用RBF神经网络进行模式识别处理，正确识别率达到93.3%，证明对小麦霉变的检测是可行的、有效的。进一步的研究还对电子鼻装置的设计进行了稳定性的优化，包括6点平滑法去除传感器的噪声［28］、随机共振法处理试验数据克服传感器基线漂移以及不同传感器阵列的组合优化等［29］，此外电子鼻仪器的设计也向便携式发展［30］。国外在储粮霉菌检测应用方面起步较早，Jonsson等［22］曾应用研制的电子鼻装置判别粮食是否发霉以及霉变程度，Roberto Paolesse［31］应用电子鼻对储藏中不同谷类表面环境进行气体成分分析，并通过GC－MC进行可靠性分析，成功地判定了发生霉变的谷类。N.Magan等［19］对电子鼻的分析表明，根据某类霉菌特殊的代谢物质可以判定粮食受到何种霉菌的污染。在中国，对电子鼻的应用性研究已经可以在粮食霉变初期做到成功预警。近年来，主要利用商品化电子鼻结合自行研制设备进行检测条件的优化和应用性试验，宋伟等［32］应用德国PEN3便携式电子鼻检测储藏中粳稻的气体环境，应用偏最小二乘（PLS）分析法提升了预测粳稻中霉菌数量的可行性。惠国华等［33］自行研制的电子鼻可以追踪储粮霉变的过程。周显青等［34］对电子鼻传感器阵列进行优化，并对40种玉米样品进行霉菌检测，应用不同算法（Euclid、Malahanobis、Kohonen和DFA）分析后证明，Kohonen和DFA算法对玉米霉变程度的判断准确率可大幅提升。以上研究结果证明，电子鼻检测技术是依据微生物代谢特性快速检测储粮安全的方法，可在储粮早期霉变检测中发挥重要作用。

4 微生物酶活性检测技术

微生物酶活性检测是根据霉菌在进行新陈代谢的同时，会不断向外界分泌胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶、过氧化氢酶等，利用菌体产酶的代谢特性间接检测粮食带菌量的方法。郭雷等［35］对储粮主要危害性霉菌过氧化氢酶特性进行了研究，证明了不同种类储粮霉菌可以分泌过氧化氢酶，且过氧化氢酶的酶活性与菌体数量具有显著的线性相关性，酶活性越大，菌体数量越多。笔者［36］曾以对基于霉菌分泌过氧化氢酶的特性与粮食带菌量变化建立的联系为依据提出了粮食微生物活性的概念，并对建立的微生物活性检测法进行可靠性研究，使微生物活性检测在早期预防粮食霉变中可以获得较准确的信息。试验结果表明，在不同培养基培养霉菌菌体数量不变的条件下，检测的活性值却有较大的差异，但与霉菌生长的迹象一致，因此，在霉菌还未出现明显生长的情况下，可以快速、准确地发现储粮的异常状态。在后续研究［37］中，对不同水分、不同种类的粮食进行微生物活性与粮食品质相关性的研究表明，粮食微生物活性值与粮食品质变化有显著的相关性，进一步证明了该方法用于检测粮食微生物的准确性。魏鑫等［38］利用微生物活性检测技术对不同品种小麦霉菌活动的差异进行了研究，该方法与传统的平板菌落计数法的分析结果高度一致，并且采用微生物活性检测技术比传统检测方法更为灵敏、可靠。胡元森等［39］利用霉菌有氧呼吸过程中脱氢酶的特性，建立了适用于粮食中几种代表性霉菌脱氢酶活性的测定方法，用该方法测定小麦储藏过程中微生物活性值与霉菌数量也发现有较好的相关性。

微生物酶活性检测技术在实仓储粮安全监测中也有一些试验性的应用。田海娟等［40］利用微生物活性检测技术对稻谷储藏期间微生物的活动规律进行了研究，在高相对湿度环境下，粮堆表层的微生物活性值变化明显，且粮层有阻挡湿度扩散的作用，粮堆下层微生物活性值变化不明显。在超过1 000t的大型储藏玉米仓中，利用微生物活性检测技术监测仓内高水分玉米在系统升温及通风降水过程中微生物活动的状况，根据微生物活性值制定通风、加热等参数，达到了早期防霉储藏的目的［41］。微生物酶活性检测法与传统霉菌检测方法相比，具有耗时少、灵敏度高、检测结果更加准确的特点，其显示结果反应粮食表面活菌的数量，更加贴切粮食防霉储藏的本质。微生物活性检测技术可以提高储粮霉菌早期预防的效率，最大限度维护粮食品质，提高储粮的安全性。

5 展望

储粮安全与粮食微生物的存在状态密切相关，休眠或非生长状态的微生物对储粮安全没有影响，粮食安全的威胁来自于活动着的微生物，其主要危害类群是霉菌。立足于对霉菌生长和代谢特性相关的生物学特性进行检测，借鉴食品微生物的某些成熟的方法［42］，可以满足对储粮安全性的有效监测。现有的相关方法应该根据粮食的储藏特性和具体需求，进一步对检测方法进行适应性研究，对仪器、设备及检测过程进行优化；同时也可通过对微生物的多种生物学特性进行综合分析，弥补单因素检测的不足，更加准确、有效地反映储粮安全性的真实状态，提高储粮安全早期预防的效果，为减少储粮损失提供技术基础。

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