抗体文库展示技术在抗体新药开发中的应用

张 磊，李金阳，朱克旭

1975年，Kohler和Milstein将分泌抗体的B细胞和骨髓瘤细胞融合，用杂交瘤细胞培养生产单克隆抗体[1]。随后，1986年，美国食品药物管理局(FDA)批准了第一个用于治疗的单克隆抗体[2]，一种定位于人类的CD3的鼠源抗体。由于鼠源抗体具有免疫原性，导致在人体内迅速地被清除，从而表现为低效率治疗效果，高风险的输液反应，因此，除2002年的定位于 CD20，治疗 Non－Hodgkin lymphoma的 Zevalin以外[3]，FDA没有再批准任何的鼠源抗体。1994年，第二个治疗性抗体由 FDA 批准上市，ReoPro[4]，anti-GpⅡb/gpⅡa，治疗心血管疾病，抗体的类型为嵌合型抗体，标志着抗体的发展有了明显的倾向-人源化。

1 抗体人源化的历程

随着对抗体结构认识的深入，鼠源抗体局部到整体的人源化逐步实现经历了3个过程。(a)首先出现的是Fc片段被人源化，保留鼠源的Fab。Fab是负责抗体与抗原识别的区域[5]，而Fc是控制抗体体内效应功能的部分。(b)将鼠源的Fv区和人源的恒定区相连，减小了鼠源片段的大小，这样的抗体称为人鼠嵌合抗体。嵌合抗体能够极大的减小免疫原性，接受抗体治疗体内产生人抗鼠抗体(human anti－mouse antibodies，HAMA)的患者比例[6]可以显著降低。(c)将鼠源抗体的CDR(complementarity determining region)区移植到同源的人类抗体 β-sheet骨架区(CDR －grafting)[7]，能够继续减低产生HAMA的风险。CDR-grafting的抗体被称为人源化抗体(humanized antibody)[8-9]。事实上，人源化抗体仅仅只是比嵌合抗体免疫原性低。

如今，用于治疗的全人化抗体也已经产生，即完整抗体全部都是来源于人的基因。目前产生全人化抗体有2种方法，分别是重组抗体文库的不断突变与筛选和转基因动物[10-11]，涉及展示技术在内的多种新技术。

2 通过重组抗体文库突变与筛选获得全人化抗体

由重组抗体文库分离产生抗体原理上模拟体内产生抗体的过程，多种选择平台均包含免疫系统产生抗体的几个关键步骤:首先是通过克隆多样化连接的抗体基因，构建抗体基因文库。然后，应用不同的展示技术，表达抗体基因，将抗体的基因型和表型偶联。再然后是通过抗原作用，施加选择压力，挑选合适的抗体。最后，扩增筛选出来的抗体。将获得的抗体基因进行突变处理，用于新一轮的筛选，如此循环，直至获得满意的抗体。

2.1 重组抗体文库 总体上包括2种类型:第1种是从免疫的动物或者是自然感染的人体内分离得到的，针对于某种抗原，具有一定程度特异性的免疫抗体基因库[12]。第2种是由非免疫来源或者是半合成的非免疫抗体基因库，不具有倾向性。

2.1.1 免疫抗体文库 首先从B细胞中PCR扩增出抗体的重链和轻链群，然后将它们连入合适的载体表达随机的联合抗体文库。相比于杂交瘤技术，用相同的免疫供体，重组免疫文库的方法可以获得更多的抗体，并且可以用体外选择来富集天然很稀少的抗体类型。免疫文库能够用于分离非免疫文库不容易产生的人体免疫和疾病相关的特殊性质的抗体，同时还可以用于分子水平的体液免疫系统的研究。如果需要，用免疫文库的方法可以保持天然细胞内重链和轻链的连接，也可以高通量的扩增出单个细胞内的重链和轻链。

2.1.2 非免疫文库 来源于非免疫供体或者是半合成的抗体文库并不针对于某一种特定的抗原，因此它们能够用于分离针对于各种各样不同性质抗原的抗体。非免疫抗体库起源于天然的、未免疫的重组V区基因，文库减少了抗原倾向性，能够用于分离免疫文库很难获得的针对自身抗原的抗体。完全合成抗体文库是完全于体外构建，合成的多样性避免了体内天然抗体库的倾向性和抗体冗余的影响，允许人工对V区基因遗传组成和抗体多样性程度的控制[13]。半合成的抗体库继承了天然抗体库和完全合成抗体库的优点:增加了天然抗体库的多样性，而保持了一定程度上功能的多样性。

2.2 抗体文库筛选技术

2.2.1 噬菌体展示 Fd和M13噬菌体展示是用于抗体文库展示和筛选使用最广泛的方法。将抗体片断表达于噬菌体分子表面，它的编码基因融合于噬菌体的一个包膜蛋白克隆进入能够被包装成为噬菌体颗粒的载体之中。最常用的系统是:(a)使用方便、筛选更高亲和力抗体的单价展示，(b)通过直接融合或者二硫键桥将抗体与小衣壳蛋白pIII连接，(c)同时用相比噬菌体载体更容易克隆的噬菌粒去操作。

目前，噬菌体展示技术已经成功的应用于如下几个方面:非免疫和合成抗体文库高亲和力抗体的分选[14]，包括针对于人体自身抗原的抗体的分选，通过亲和成熟体外产生皮摩尔级亲和力抗体[15]，从动物或人类供体的免疫或者非免疫文库中发现独特性质的抗体[16]。

2.2.2 核糖体和mRNA展示 在核糖体展示中，核糖体将抗体和编码的mRNA联系在一起，在翻译结束以前，核糖体被停止住，而不释放出多肽。整个三元复合物作为整体用于筛选[17]。嘌呤霉素作为转换分子建立抗体和mRNA之间的共价键。

核糖体展示技术是较新的方法，它依赖于抗体片断与编码抗体的mRNA形成稳定的复合物，分离mRNA，然后扩增，获得抗体的基因。这种方法已经成功应用于抗体的亲和成熟领域[18-20]。

2.2.3 微生物细胞展示 酵母细胞展示技术将抗体与酵母细胞壁上定位的α-凝集素酵母黏附受体相融合，展示于细胞表面。此种方法用于构建人类非免疫scFv文库，获得了超过109克隆，能够有效的用磁珠选择然后流式细胞术分选产生几纳摩尔亲和力的抗体[21]。噬菌体展示和酵母展示相结合[22]，使用酵母细胞交配体系产生组合多样性约1014克隆数的文库。

酵母细胞表面展示技术可以结合流式细胞分选来筛选抗体文库[21，23]。运用随机突变的方法来使得VH和VL基因多样化，酵母展示可以获得最高亲和力的任何抗体(48fM)[24]。

2.2.4 其他筛选平台 直接进化的平台包括逆转录病毒展示[25]，慢病毒展示[26]，淋巴细胞展示[27]和体外区域化的微珠展示[28]等。虽然这些方法都有特定的理论优势，由于不同的原因，他们用于抗体文库筛选的有效性仍然受到限制，而且理论的优势尚待实验检测。

2.3 筛选抗体文库的方法 筛选过程大致如下，噬菌体展示首先将抗体融合的噬菌体暴露于抗原分子，允许抗原特异性的噬菌体抗体结合。然后将结合的噬菌体洗脱感染细菌细胞。原则上只需一轮筛选，但是每一轮选择过程都会有非特异性结合的影响，因此，多次循环的选择和扩增才能够从文库中选出最好的结合物。对于核糖体展示技术最好使用纯化的抗原，而酵母细胞展示技术比较适合于细胞分选。

体外展示技术原理上可以直接用自动化来操作，进化过程主要依赖于对污染和非特异性扩增非常敏感的PCR反应，而没有复杂的宿主细胞和噬菌体操作，体外区域化的核糖体展示和微珠展示都可以很容易通过自动化操作。

2.4 抗体的亲和成熟 抗体的效果主要由与抗原作用的亲和力所决定，体内免疫系统中，抗体的亲和成熟是通过逐步的引入突变后，在不断增加的选择压力下选择突变体来实现的。体外最初和最简单的亲和成熟，是在与抗原相互作用紧密相关的若干残基CDRs中，用寡聚核苷酸和PCR导入多样性构建抗体文库，鉴定筛选最高亲和力的单克隆[29]。在突变热点和结构分析得到的影响亲和力重要位点的随机突变，也是一种引入新突变体的有效方法。集中位点突变的优点是开始只有很小的文库需要筛选，但是，缺点是需要同时结合筛选抗体的亲和力和动力学特性。

综上所述，体外产生人源化抗体的过程就是首先构建抗体展示文库，包括免疫文库和辅助合成的非免疫文库，运用噬菌体展示、酵母展示或者核糖体展示技术等，将抗体展示到固定化的抗原结合，通过优化条件的温浴、结合和洗涤、洗脱过程，自动化的筛选合适亲和力和动力学特性的抗体。目前而言，展示技术还不能广泛的应用于完整IgG抗体的展示，需要首先片断化展示后重建完整抗体分子。一轮文库抗体展示筛选往往会因为非特异性的结合或亲和力低下等原因，不能得到适合于诊断或治疗的满意分子。类似于体内的亲和成熟过程可以进行多次累积的突变和筛选，集中位点的突变和特异条件下筛选大范围突变分子2种方法可以用来改善抗体的结合特性，重复的突变与筛选过程相结合可以得到高亲和力的人源化抗体分子。

[1]Kohler G，Milstein C.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J].Nature，1975，256(5517):495-497.

[2]An Z.Monoclonal antibodies-a proven and rapidly expanding therapeutic modality for human diseases[J].Protein ＆ Cell，2010，1(4):19-30.

[3]Grillo-López，JA.Zevalin:the first radioimmunotherapy approved for the treatment of lymphoma Expert Review of Anticancer Therapy[J].2002，2(5):485-493.

[4]Hudson PJ，Souriau C.Engineered antibodies[J].Nat Med，2003，9(1):129-134.

[5]Seldon TA，Hughes KE，Munster DJ，et al.Improved Protein － A separation of VH3 Fab from Fc after Papain Digestion of Antibodies[J].J Biomol Tech，2011，22(2):50-52.

[6]Mateo C，Moreno E，Amour K，et al.Humanization of a mouse monoclonal antibody that blocks the epidermal growth factor receptor:recovery of antagonistic activity[J].Immunotechnology，1997，3(1):71-81.

[7]Gao J，Li B，Li H，et al.Development and characterization of a fully functional small anti-HER2 antibody[J].BMB Rep，2009，42(10):636-641.

[8]Kügler M，Stein C，Schwenkert M，et al.Stabilization and humanization of a single-chain Fv antibody fragment specific for human lymphocyte antigen CD19 by designed point mutations and CDR-grafting onto a human framework[J].Protein Eng Des Sel，2009，22(3):135-147.

[9]Hou S，Li B，Wang L，et al.Humanization of an Anti-CD34 Monoclonal Antibody by Complementarity-determining Region Grafting Based on Computer-assisted Molecular Modelling[J].J Biochem，2008，144(1):115-120.

[10]Lonberg N.Human antibodies from transgenic animals[J].Nature Biotechnology，2005，32:1117-1125.

[11]Kacskovicsc I，Cervenak J，Erdei A，Goldsby RA，Butler4 JE.Recent advances using FcRn overexpression in transgenic animals to overcome impediments of standard antibody technologies to improve the generation of specific antibodies[J].MAbs，2011，3(5):431-439.

[12]聂艳桃，何太平，雷 韬，等.免疫抗体文库的构建及亚nM高亲和力人源抗体的筛选[J].中国生物制品学杂志，2010，32(12):12.

[13]Winter G，Milstein C.Man-made antibodies[J].Nature，1991，349(6307):293-199.

[14]Finlay WJJ，Bloom L，Cunningham O，et al.Phage Display:A Powerful Technology for the Generation of High Specificity Affinity Reagents from Alternative Immune Sources[J].Methods Mol Biol，2011，681:87-101.

[15]Koide A，Tereshko V，Uysal S，et al.Exploring the capacity of minimalist protein interfaces:interface energetics and affinity maturation to picomolar KD of a single-domain antibody with a flat paratope[J].J Mol Biol，2007，373(4):941-953.

[16]Kramer RA，Marissen WE，Goudsmit J，et al.The human antibody repertoire specific for rabies virus glycoprotein as selected from immune libraries[J].Eur J Immunol，2005，35(7):2131-2145.

[17]Plückthun A.Ribosome display:a perspective[J].Methods Mol Biol，2012，805:3-28.

[18]Hufton SE.Affinity maturation and functional dissection of a humanised anti-RAGE monoclonal antibody by ribosome display[J].Methods Mol Biol，2012，805:403-422.

[19]Groves MA，Nickson AA.Affinity maturation of phage display antibody populations using ribosome display[J].Methods Mol Biol，2012，805:163-190.

[20]Grimm S，Yu F，Nygren P-Å，et al.Ribosome display selection of a murine IgG Fab binding affibody molecule allowing species selective recovery of monoclonal antibodies[J].Mol Biotechnol，2011，48(3):263-276.

[21]Feldhaus MJ，Siegel RW，Opresko LK，et al.Flow-cytometric isolation of human antibodies from a nonimmune Saccharomyces cerevisiae surface display library[J].Nat Biotechnol，2003，21(2):163-170.

[22]Beucken Tvd，Pieters H，Steukers M，et al.Affinity maturation of Fab antibody fragments by fluorescent-activated cell sorting of yeast-displayed libraries[J].FEBS Lett，2003，546(2-3):288-294.

[23]Gray SA，Weigel KM，Miller KD，et al.Flow cytometry-based methods for assessing soluble scfv activities and detecting antigens in solution[J].Biotechnol Bioeng，2010，105(5):973-981.

[24]Boder ET，Midelfort KS，Wittrup KD，et al.Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(20):10701-10705.

[25]Urban JH，Schneider RM，Compte M，et al.Selection of functional human antibodies from retroviral display libraries[J].Nucleic Acids Res，2005，33(4):e35.

[26]Taube R，Zhu Q，Xu C，et al.Lentivirus display:stable expression of human antibodies on the surface of human cells and virus particles[J].PLoS One，2008，3(9):e3181.

[27]Alonso-Camino V，Sánchez-MartínD，Compte M，et al.Lymphocyte display:a novel antibody selection platform based on T cell activation[J].PLoS One，2009，4(9):e7174.

[28]Sepp A，Tawfik DS，Griffiths AD，et al.Microbead display by in vitro compartmentalisation:selection for binding using flow cytometry[J].FEBS Lett，2002，532(3):455-458.

[29]Wu H，Beuerlein G，Nie Y，et al.Stepwise in vitro affinity maturation of Vitaxin，an alphav beta3-specific humanized mAb[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(11):6037-6042.