利用双杂交系统筛选并鉴定与GPR30相互作用的蛋白

张 蕾，常 宏，徐 东

（1.首都医科大学宣武医院心脏中心，北京100053；2.河北医科大学基础课教学部生物化学教研室，河北石家庄050091）

·论 著·

利用双杂交系统筛选并鉴定与GPR30相互作用的蛋白

张 蕾1，常 宏2*，徐 东1

（1.首都医科大学宣武医院心脏中心，北京100053；2.河北医科大学基础课教学部生物化学教研室，河北石家庄050091）

目的筛选并鉴定与GPR30相互作用的蛋白，为GPR30蛋白亚细胞定位和功能研究提供线索。方法应用酵母双杂交技术，构建诱饵表达载体Pgbk/GPR30，与人卵巢互补DNA（complementary DNA，cDNA）文库共转化酵母菌AH109，筛选阳性克隆并测序。利用哺乳动物双杂交系统验证GPR30与候选蛋白的相互作用。结果从人卵巢cDNA文库中筛选出4个与GPR30结合的蛋白基因，分别是小G蛋白Rab8a、Rab40a、NM23-H2和TACC3。其中，小G蛋白Rab8a、Rab40a与GPR30的相互作用在哺乳动物双杂交系统中得到验证。结论小G蛋白Rab8a和Rab40a可能参与了GPR30细胞内转运或与GPR30参与的信号转导有关。

受体，雌激素；双杂交系统技术；卵巢

雌激素是一种重要的内分泌激素，尤其对维持女性多种器官的生理功能具有不可替代的作用，并与乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌的发生发展密切相关。在细胞分子水平上，雌激素的作用是通过细胞内雌激素受体（estrogen receptor，ERα）介导的。ERα与ERβ作为转录调节因子的功能已被广泛研究。但20世纪90年代，一种新型的ER即G蛋白耦联受体30（G protein-coupled receptor 30，GPR30）被数个研究团队相继分离出来。GPR30在不表达ER与ER的靶器官中参与对雌激素的生理反应，并且与乳腺癌、宫颈癌等恶性肿瘤的发生发展有关［1－4］。但是，目前对GPR30的功能尚不十分明确，尤其是亚细胞功能定位与参与的信号转导途径仍有很大争议［5－7］。为此，本研究结合酵母双杂交与哺乳动物双杂交系统，从人卵巢cDNA文库中筛选与GPR30相互作用的蛋白，旨在为进一步研究GPR30功能提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料：大肠杆菌JM109为河北医科大学基础课教学部生物化学教研室保存。酵母菌株AH109，营养缺陷培养基，pGBK质粒与matchmaker人卵巢cDNA蛋白表达文库为Clontech公司产品。CheckMate Mammalian Two-Hybrid System与Dual-Luciferase Reporter Assay System购自Promega公司。DNA重组所用限制性内切酶，T4DNA连接酶，PCR相关试剂，胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒均购自TAKARA公司。细胞培养用DMEM培养基及胎牛血清，转染试剂lipofectamine2000购自Invitrogen。HEK293细胞株为赠送。引物合成及测序由华大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 诱饵质粒的构建与鉴定：PCR扩增GPR30全长，上下游引物5′端分别引入EcoRI与BamHI位点。PCR产物经回收与pGBKT7载体同时用EcoRI与BamHI双酶切。酶切产物回收后以T4DNA连接酶连接。重组质粒pGBK-GPR30以测序鉴定。

1.2.2 诱饵蛋白毒性和自激活检测：将空质粒pGBKT7与重组质粒pGBKT7-GPR30分别转化酵母AH109细胞，SD/-Trp缺陷培养基30℃培养72h。挑取单克隆菌落至液体SD/-Trp培养基30℃振荡培养24h，比较两者光密度600（optical density 600，OD600）值，明确GPR30蛋白对酵母菌株AH109有无毒性。将pGBKT7-GPR30质粒转化AH109细胞，再将转化的细胞分别铺在不同的缺陷培养板SD/-Trp、SD/-His/-Trp、SD/-Ade/-Trp上，30℃96h观察酵母生长情况。

1.2.3 人卵巢cDNA文库筛选：将等量的pGBKT7-GPR30质粒与文库质粒共同转化AH109细胞，转化产物铺在50个直径150mm的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp缺陷培养板上，30℃培养至克隆出现（6～9d）。

1.2.4 阳性文库质粒的分离：利用酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，氯化钙法转化JM109大肠杆菌感受态细胞，铺LB/Amp板，提取阳性菌落质粒。

1.2.5 阳性质粒的酶切分类和再验证；将筛选出的阳性质粒，用内切酶HindⅢ酶切并进行电泳，将相对分子质量一致的质粒归为一组。每组选取1个质粒与pGBKT7-GPR30质粒以一对一方式再次转化AH109细胞，在SD/-Ade/-His/-Trp缺陷培养板上验证。验证阳性者送测序。测序结果利用美国国家生物技术信息数据库进行同源性比对。

1.2.6 利用哺乳动物双杂交系统验证：GPR30与候选蛋白的相互作用PCR扩增GPR30全长，上下游引物5′端分别引入BamHI与KpnI位点。PCR产物经回收与pBIND载体同时用BamHI与KpnI双酶切。酶切产物回收后以T4DNA连接酶连接。以同样方法将候选基因插入pACT质粒中。将GPR30-pBIND与候选基因-pACT质粒共转染HEK293细胞，按照Dual-luciferase reporter assay system说明书进行操作，检测荧光素酶报告基因活性。

2 结 果

2.1 重组质粒的构建与鉴定：重组质粒经EcoRI与BamHI酶切，有约1120bp片段插入（图1）。测序表明插入片段与GPR30开放阅读框序列完全相符，无碱基突变和缺失，插入方向正确，未发生读码框架改变。

2.2 诱饵蛋白的毒性和自激活检测：pGBKTGPR30与pGBKT7转化的AH109酵母细胞培养24h后，OD600分别为1.033与1.041，表明诱饵蛋白对AH108细胞无明显毒性。

对照pGBKT7-GPR30转化的AH109酵母细胞在SD/-Trp培养板上的生长情况，在SD/-His/-Trp和SD/-Ade/-Trp培养板上无克隆生长，证明pGBKT-GPR30质粒对报告基因无自激活作用（图2）。

2.3 文库筛选及阳性克隆鉴定：pGBKT-GPR30与人卵巢cDNA文库共转化AH109酵母细胞后，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp缺陷培养基上获得46个克隆。全部克隆经酵母质粒提取后，再在大肠杆菌JM109中扩增。将46个质粒以HindⅢ酶切并进行电泳。相同大小的酶切片段视为同一插入片段。这样，共得到8组阳性克隆质粒。将这8个质粒与pGBKT-GPR30一对一转化AH109细胞进一步排除假阳性，最终得到6个阳性克隆（图3）。测序及比对结果表明，有2个为线粒体蛋白，是常见的假阳性序列。其余4个克隆，分别编码Rab8a、Rab40a、GGA3和TACC3蛋白，做进一步鉴定（图4）。

2.4 阳性克隆的哺乳动物双杂交鉴定：将Rab8a、Rab40a、GGA3和TACC3编码序列插入pACT载体，与GPR30-pBIND载体共转染HEK293细胞，检测细胞中萤火虫荧光素酶含量表明，Rab8a和Rab40a携带的报告基因成功激活萤火虫荧光素酶表达（图5）。

3 讨 论

GPR30可与雌激素特异性结合并介导环磷酸腺苷活化，但其作用模式和效应与ER不同，且与ER没有同源性［8］。同时，GPR30具有经典的7次跨膜结构，属G蛋白耦联受体家族。因此，可视为一种新型的雌激素膜性受体。但是，还未揭示GPR30是如何参与恶性肿瘤的发生发展过程，甚至其亚细胞定位仍存在很大争议。有报道［5］指出，在共聚焦显微镜下观察到绿色荧光蛋白标记的GPR30主要集中在COS-7细胞的内质网中。但亦有报道［9］指出HEK293细胞中GPR30表达在细胞膜上。本实验利用酵母和哺乳动物双杂交系统成功地筛选到2个可能的GPR30相互作用蛋白，Rab8a和Rab40a，为进一步研究GPR30的亚细胞定位和参与的信号途径提供了线索。Rab蛋白是小分子三磷酸鸟苷结合蛋白家族中最大的亚家族。在人类已经发现超过60余种Rab蛋白，它们广泛参与细胞内囊泡的运输，调节生物体内各种蛋白在细胞内外的正确运输和分配［10］。其中Rab8更是被报道参与GPCR从内质网到细胞膜的定向运输［11］。而Rab40，至今并没有深入的细胞功能研究。我们推测，或许Rab8和Rab40在不同细胞和组织的表达差异，造成了GPR30在不同的细胞模型中有不同的亚细胞定位。本实验利用酵母双杂交与哺乳动物双杂交系统相结合的方法，对寻找结构复杂蛋白的相互作用蛋白进行了探索。在酵母双杂交系统中，由于蛋白质表达在酵母细胞中，往往不能象在哺乳动物细胞中进行正确的三维折叠和翻译后修饰，从而易造成假阳性。因此，酵母双杂交的结果通常要进行免疫共沉淀等实验进一步确认。而GPR30属7次跨膜结构蛋白，存在大量的疏水区，在相对温和的细胞裂解液中不易溶解。在含有较强变性剂的细胞裂解液中，蛋白质与蛋白质的相互作用又容易被破坏。因此，利用免疫共沉淀验证多次跨膜受体的相互作用蛋白易造成假阴性。因此，在设计本实验时，我们利用哺乳动物双杂交系统做进一步验证。哺乳动物双杂交系统具有与酵母双杂交系统相同的作用原理，但是蛋白在哺乳动物细胞中表达，其构象和修饰接近生理状态，容易排除假阳性［12］。本实验中，NM23-H2和TACC3由于无法在哺乳动物双杂交系统中得到证明而被排除。

综上所述，本实验成功鉴定出与GPR30相互作用的2个蛋白——同属小G蛋白家族的Rab8和Rab40，为进一步研究GPR30在细胞内的转运提供了线索。（本文图见封二）estrogen receptor，GPR30，with breast tumor metastasis and transactivation of the epidermal growth factor receptor［J］.Steroids，2008，73（9/10）：870－873.

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（本文编辑：赵丽洁）

［1］FILARDO EJ，QUINN JA，SABO E.Association of themembrane

SCREENING OF GPR30 INTERACTING PROTEINS BY TWO-HYBRID SYSTEM

ZHANG Lei1，CHANG Hong2*，XU Dong1
（1.Department of Cardiology，Xuanwu Hospital，Capital Medical University，Beijing 100053，China；2.Department of Biochemistry，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050091，China）

receptors，estrogen；two-hybrid system techniques；ovary

R349.81

A

1007-3205（2013）04-0378-03

2013－02－25；

2013－04－02

张蕾（1974－），女，湖北武汉人，首都医科大学宣武医院主治医师，医学硕士，从事影像学及细胞生物学诊断研究。

*通讯作者。E-mail：ch720321＠126l.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.04.003

【关键词】ABSTRACT：ObjectiveTo screen and identify the GPR30 interacting proteins and provide clues for GPR30 protein subcellular localization and cellular function.M ethodsThe bait expression vector pGBK/GPR30 was constructed and co-transformed with human ovarian cDNA library into yeast AH109 cells for yeast two-hybrid screening.Candidate interacting proteins were confirmed by mammalian twohybrid system.ResultsThe genes coding for four proteins that can bind to GPR30 were selected from human ovarian cDNA library，small G proteins Rab8a，Rab40a，NM23-H2 and TACC3.And the interaction between GPR30 and small G proteins Rab8a，Rab40awas confirmed bymammalian two-hybrid system.Conclusion Small G proteins Rab8a and Rab40amay be involved in the intracellular transport of GPR30 or GPR30 mediated signal transduction by direct interaction.