枯草杆菌溶菌素9在低密度脂蛋白代谢中作用的研究进展

张明明（综述），宋光耀（审校）

（河北省人民医院检验科，河北石家庄050051）

枯草杆菌溶菌素9在低密度脂蛋白代谢中作用的研究进展

张明明（综述），宋光耀*（审校）

（河北省人民医院检验科，河北石家庄050051）

桔草杆菌蛋白酶9；脂蛋白类，LDL；综述文献

近年来研究显示枯草杆菌溶菌9（proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9）是导致常染色体显性高胆固醇血症的重要基因［1］，它是迄今为止已经确定的枯草杆菌前蛋白转化酶超家族的第9个成员，也被称作神经凋亡调节转化酶1（neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC-1），PCSK9分布于肝脏、小肠、小脑、肾脏，在肝脏中表达量最高，该基因对胚胎时神经元分化及肝脏再生起重要的作用，可通过降解肝脏细胞上的低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDL-R）来调控血浆中LDL的水平，增强PCSK9活性的突变可以导致高胆固醇血症和早发冠心病；降低PCSK9活性的突变则导致相反的效应，即降低LDL水平从而减少冠心病的发病几率。虽然PCSK9的作用机制尚未明确，但PCSK9突变可能为降低血浆LDL水平、防治动脉粥样硬化和早发冠心病提供新的治疗靶点。

1 PCSK9的结构特点

PCSK9编码的蛋白质称为NARC-1，一种新的前蛋白转换酶，属于枯草蛋白酶亚家族，该基因位于染色体1P32.3，共有12个外显子，编码含692个氨基酸残基的蛋白质，其氨基酸序列可分为信号序列、前片段、催化域、P-域和富含半胱氨酸的碳末端几个结构域。152位是自身催化裂解的断裂部，催化区域包含具有催化能力的三联体Asp186-His226-Ser386以及氧化区域Asn317。PCSK9缺乏蛋白转化酶家族调节钙依赖且调节pH值的P结构域（P-domain）［2］，催化域后是一段含有279个氨基酸的富含半胱氨酸的碳末端。蛋白初合成时是一段72kDa的前体，为可溶性的酶原状态，在内质网经过自身催化后在前片段和催化域之间发生断裂，PCSK9分子的断裂位点（Val-Phe-Ala-Gln↓Ser-Ile-Pro），与其他的前蛋白转化酶不一样。PCSK9的自身催化断裂不需要钙离子［3］。成熟的PCSK9和相关的前片段在分泌前都要经过酪氨酸的硫酸酯化，但PCSK9翻译后修饰的作用尚未明确［4］。

2 PCSK9表达对LDL-R水平的调节

PCSK9基因突变导致高胆固醇血症这一发现证实基因突变后或是通过增加PCSK9的正常活性，或是通过赋予蛋白某种新的功能。有研究显示在野生型C57BL/6小鼠体内导入腺病毒介导的人PCSK9基因使其过表达，与仅导入腺病毒空载体的小鼠相比，血浆总胆固醇明显提高，非高密度脂蛋白胆固醇C提高5倍，其表型接近于LDL-R基因敲除小鼠；而将PCSK9基因导入胆固醇水平原本较高的LDL-R基因缺陷小鼠，与对照组相比，血脂水平并未进一步增高，提示PCSK9基因增高血浆LDL水平的过程依赖于LDL-R的存在［5］。体外实验证实，将人PCSK9基因导入培养的细胞，并未见LDL-R mRNA水平改变，但LDL-R蛋白表达却显著减少，且细胞对荧光标记的LDL内吞功能显著降低。PCSK9基因降低细胞表面LDL-R蛋白并干扰LDL-R介导的细胞对胆固醇的摄取，但也有人［6］认为PCSK9基因可能不是通过传统的固醇调节元件介导的转录途径调节LDL-R表达，而是通过新的机制调节LDL-R功能。在McA RH7777大鼠肝癌细胞中过表达野生型PCSK9，使LDL-R蛋白减少72％，与1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（1，1′-dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，DiI）标记的LDL的结合降低52％，而在人肝癌细胞株HuH7中瞬时转染双链siRNA使LDL-R的表达、DiI和LDL的结合分别增加33％和2.2倍［7］。这提示PCSK9可能通过对LDL-R的负向调节而发挥作用。

与野生型小鼠相比，PCSK9-/-小鼠的血浆胆固醇水平降低48％，肝LDL-R蛋白的水平升高2.8倍，而LDL-R mRNA则没有明显变化，这与PCSK9过表达降低LDL-R蛋白水平而不改变LDL-R mRNA相一致［8］。因此，可以推断无论是野生型还是突变体，PCSK9的过表达通过翻译后机制来降低LDL-R的水平。

3 细胞内PCSK9的作用位点

在细胞内PCSK9和LDL-R的作用路径一致，在细胞表面则有所不同，LDL-R与细胞膜结合而PCSK9则迅速分泌到细胞质中去。PCSK9还可以通过肝脏分泌到细胞外，因此可以在血浆中检测到［9－10］。PCSK9在细胞内的作用位点尚未明确。在HepG2细胞中，PCSK9的过表达并不能影响LDL-R合成或从内质网向外转运，而且蛋白体抑制因子也不干扰PCSK9介导的LDL-R水平的下调。PCSK9的高表达增加了成熟的、糖基化形式的LDL-R的降解。但布雷菲德菌素a（一种可以引起高尔基复合体分解的真菌毒素）可以阻止PCSK9对LDL-R的降解。这些资料显示在LDL-R从内质网向细胞膜表面转运的过程中，PCSK9可促进其降解［11］。

另一方面，PCSK9在分泌通道中并无活性，而只在分泌后作用于LDL-R。在分泌过程中，前片段与成熟蛋白紧密结合，据推测其作用是抑制PCSK9的催化活性。在其他的前蛋白转化酶中，前片段在高尔基体或分泌后经过第2次蛋白酶解加工解除其抑制作用，暴露酶活性。初步的实验证据显示PCSK9还可以在细胞外发挥其作用，把纯化的PCSK9或含PCSK9的条件培养基作用于HepG2细胞，可以减少HepG2细胞表面LDL-R的数目。当外源性PCSK9作用于细胞时，LDL-R与PCSK9迅速发生免疫沉淀反应，这一现象暗示两种蛋白之间存在某种物理联系，在常染色体隐性高胆固醇血症（autosomal recessive hypercholesterolemia，ARH）患者中，缺乏一种LDL-R细胞内摄作用所必需的内吞衔接蛋白，而这种蛋白对PCSK9介导的LDL-R的降解是必要的，ARH患者缺少这种蛋白，LDL-R和PCSK9都不能被细胞摄入，不能发挥相互作用，因此LDL-R的数目没有改变［12］。以上研究结果揭示了PCSK9加速LDL-R降解的几种作用机制，在细胞表面，PCSK9以无催化活性的形式与LDL-R结合，然后进入细胞内，在酸性环境下发挥其作用，导致LDL-R降解。另一方面，与LDL-R结合，PCSK9可能妨碍细胞内摄作用后LDL-R的正常再利用，使LDL-R在溶酶体降解而不是回到细胞表面。

4 PCSK9功能获得型突变

与高胆固醇血症有关的PCSK9突变称为功能获得型突变。PCSK9选择性错义突变可以导致高胆固醇血症。血浆中主要携带胆固醇的脂蛋白，LDL-C的水平取决于LDL生成与清除的相对比率。

Lambert等［13］在2个法国家庭中发现了位于1号染色体短臂三区二带与ADH相关的错义突变，这两个错义突变是PCSK9外显子2的S127R（625T＞A）突变和外显子4的F216L（890C＞T）突变。

自此开始，陆续有人报道PCSK9的错义突变，这些突变均导致高胆固醇血症，而且报道中没有发现LDL-R和ApoB基因突变。包括L108R突变［1］、D35Y突变［1］、D374Y突变［14－15］，R218S、R357H突变［16］、c.1863＋94A＞G突变［17］、I474V突变［18］、外显子6的R306S突变［19］、A617D突变［20］以及E670G突变［21］等。另外，在FH患者中还发现了3种PCSK9错义突变R469W、N425S、R496W。其中，外显子12的E670G突变［21］可引起血浆LDL-C水平的升高，有3.5％变异率，是LDL-C水平和冠状动脉粥样硬化严重程度的基因标志物。

5 PCSK9功能缺失型突变

PCSK9引起低胆固醇血症的突变又称为功能缺失型突变。无义突变和错义突变均可引起低胆固醇血症。Cohen等［22］对DHS中1769例LDL-C水平低于正常人群5个百分点的非裔美国人PCSK9的编码区域进行测序，发现每50例非洲裔美国人中就有1例发生了无义突变Y142X或C679X，使LDL的水平下降40％。在DHS中1784例非非裔的美国人中，1例西班牙人和1例欧洲人的PCSK9基因中均发现了C679X突变，该突变导致了终止密码子提前出现。但在携带该突变的杂合患者中发现胆固醇的内源性生物合成或肠道吸收似乎都没有发生改变。在DHS研究的非裔美国人中，Y142X和C679X突变率为1.8％；而在伊利诺斯州库克郡的850例非裔美国人中，上述两个突变的发生率为2.2％。在来自优鲁巴语乡村社区的549例尼日利亚人中C679X突变率为1.4％。在津巴布韦653例产妇中发现3.7％的患者存在C679X突变，而且血浆LDL-C水平明显低于无突变人群［23－24］。此外，Zhao等［25］还发现YI42X突变影响mRNA的生物合成过程，故不能生成成熟的PCSK9蛋白。C679X突变不改变自身催化活性，但C-末端的半胱氨酸提前终止干扰蛋白的正确折叠，导致成熟蛋白滞留于内质网。这些结果提示YI42X突变影响蛋白的合成，C679X突变干扰蛋白的折叠。

其他与血浆LDL-C水平下降有关的PCSK9突变陆续被发现，包括框内突变和错义突变，如L235F突变、A443T突变、R46L突变、Q152H突变、P174S突变、G106R突变、R237W突变［24，26－29］。其中非裔美国人中发现的L235F突变可使LDL水平下降30％，A443T突变的纯合子和杂合子使LDL-C分别下降29.2％和3.5％。R46L突变在欧洲人中的发生率为3.4％，LDL水平下降了21.3％。而Cameron等［28］认为G106R虽不影响Asp186-His226-Ser386的催化能力，但可显著降低自身催化能力，导致成熟蛋白显著减少。

6 问题与展望

PCSK9错义突变引起人类常染色体高胆固醇血症的原因即“功能获取机制”。这些致病突变基因的发现有助于深入探讨胆固醇代谢的调节机制，能进一步将LDL-C从血管中清除，阻止造成冠心病的血管斑块形成。尽管关于PCSK9基因在LDL代谢中的生物重要性的研究已经取得了很大的进展，但还有许多重要的机制和临床问题有待解决。首先，PCSK9表达和功能获得型突变促进LDL-R降解的作用机制还有待于进一步阐明；第二，尽管已经提出了PCSK9的结构模型，但晶体模型尚无报道。对PCSK9的3D结构的阐述为PCSK9的作用机制的研究提供了一个新的角度。还需要进一步证实PCSK9在细胞中的作用位点，以及LDL-R的降解是否与其催化活性相关。尽管PCSK9的遗传缺陷与独立于LDL代谢的明显表型不相关，PCSK9仍可能通过其他途径发挥作用。因此，对PCSK9研究尚不完善，需继续深入研究。

［1］ABIFADEL M，GUERIN M，BENIANNET S，et al.Identification and characterization of new gain-of-function mutations in the PCSK9 gene responsible for autosomal dominant hypercholesterolemia［J］.Atherosclerosis，2012，223（2）：394－400.

［2］BASAK A，PALMER-SMITH H，MISHRA P.Proprotein convertase subtilisin kexin9（PCSK9）：a novel target for cholesterol regulation［J］.Protein Pept Lett，2012，19（6）：575－585.

［3］DENISM，MARCINKIEWICZ J，ZAID A，et al.Gene inactivation of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 reduces atherosclerosis in mice［J］.Circulation，2012，125（7）：894－901.

［4］DEWPURA T，MAYNE J.Analyses of PCSK9 post-translational modifications using time-of-flightmass spectrometry［J］.Methods Mol Biol，2011，768（9），167－187.

［5］CAMERON J，BOGSRUD MP，TVETEN K，et al.Serum levels of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 in subjects with familial hypercholesterolemia indicate that proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 is cleared from plasma by low-density lipoprotein receptor-independent pathways［J］.Transl Res，2012，160（2）：125－130.

［6］WANG Y，HUANG Y，HOBBS HH，et al.Molecular characterization of proprotein onvertase subtilisin/kexin type 9-mediated degradation of the LDLR［J］.J Lipid Res，2012，53（9）：1932－1943.

［7］DENIS N，PALMER-SMITH H，ELISMA F，et al.Quantitative proteomic analysis of PCSK9 gain of function in human hepatic HuH7 cells［J］.JProteome Res，2011，10（4）：2011－2026.

［8］ROUBTSOVA A，MUNKONDA MN，AWAN Z，et al.Circulation proprotein convertase subtilisin/kexin 9（PCSK9）regulates VLDLR protein and triglyceride accumulation in visceral adipose tissue［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011，31（4）：785－791.

［9］ZHANG DW，LAGACE TA，GARUTI R，et al.Binding of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 to epidermal growth factor-like repeat A of low density lipoprotein receptor decreases receptor recycling and increases degradation［J］.J Biol Chem，2007，282（25）：18602－18612.

［10］FATTORI E，CAPPELLETTI M，LO SURDO P，et al.Immunization against proprotein convertase subtilisin-like/kexin type 9 lowers plasma LDL-cholesterol levels in mice［J］.J Lipid Res，2012，53（8）：1654－1661.

［11］MELONE M，WILSIE L，PALYHA O，et al.Discovery of a new role of human resistin in hepatocyte low-density lipoprotein receptor suppression mediated in part by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9［J］.J Am Coll Cardiol，2012，59（19）：1697－1705.

［12］GREFHORST A，MCNUTT MC，LAGACE TA，et al.Plasma PCSK9 preferentially reduces liver LDL receptors in mice［J］.J Lipid Res，2008，49（6）：1303－1311.

［13］LAMBERTG，CHARLTON F，RVE KA，et al.Molecular basis of PCSK9 function［J］.Atherosclerosis，2009，203（1）：1－7.

［14］SOUTAR AK.Unexpected roles for PCSK9 in lipid metabolism［J］.Curr Opin Lipidol，2011，22（3）：192－196.

［15］O′KANEMJ，MENOWN IB，GRAHAM I，et al.The detection of heterozygous familial hypercholesterolemia in Ireland［J］.Adv Ther，2012，29（5）：456－463.

［16］ALEX L，CHAHIL JK，LYE SH，et al.Differences in allele frequencies of autosomal dominant hypercholesterolemia SNPs in the Malaysian population［J］.JHum Genet，2012，57（6）：358－362.

［17］HUIJGEN R，SJOUKE B，VIS K，et al.Genetic variation in APOB，PCSK9，and ANGPTL3 in carriers of pathogenic autosomal dominant hypercholesterolemic mutations with unexpected low LDL-Cl Levels［J］.Hum Mutat，2012，33（2）：448－455.

［18］PALACIOS L，GRANDOSO L，CUEVAS N，et al.Molecular characterization of familial hypercholesterolemia in Spain［J］.Atherosclerosis，2012，221（1）：137－142.

［19］LIN J，WANG LY，LIU S，et al.A novelmutation in proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 gene leads to familial hypercholesterolemia in a Chinese family［J］.Clin Med J（Engl），2010，123（9）：1133－1138.

［20］VACA G，VÁZQUEZ A，MAGANA MT，et al.Mutational analysis of the LDL receptor and APOB genes in Mexican individualswith autosomal dominant hypercholesterolemia［J］.Atherosclerosis，2011，218（2）：391－396.

［21］AUNG LH，YIN RX，MIAO L，et al.The proprotein convertase subtilisin/kexin type9 gene E670G polymorphism and serum lipid levels in the guangxi bai ku yao and han populations［J］.Lipids Health Dis，2011，13（10）：5.

［22］COHEN J，PERTSEMLIDIS A，KOTOWSKI IK，et al.Low LDL cholesterol in individuals of African descent resulting from frequent nonsense mutations in PCSK9［J］.Nat Genet，2005，37（2）：161－165.

［23］FOLSOM AR，PEACOCK JM，BOERWINKLE E，et al.Variation in PCSK9，low LDL cholesterol，and risk of peripheral arterial disease［J］.Atherosclerosis，2009，202（1）：211－215.

［24］HUANG CC，FORNAGE M，LLOYD-JONES DM，et al.Longitudinal association of PCSK9 sequence variations with lowdensity lipoprotein cholesterol levels：the coronary artery risk development in young adults study［J］.Circ Cardiovasc Genet，2009，2（4）：354－361.

［25］ZHAO Z，TUAKLI-WOSORNU Y，LAGACE TA，et al.Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote［J］.Am JHum Genet，2006，79（3）：514－523.

［26］MAYNE J，DEWPURE T，RAYMOND A，et al.Novel loss-offunction PCSK9 variant is associated with low plasma LDL cholesterol in a French-Canadian family and with impaired processing and secretion in cell culture［J］.Clin Chem，2011，57（10）：1415－1423.

［27］SLIMANIA，JELASSIA，JGUIRIM I，et al.Effect ofmutations in LDLR and PCSK9 genes on phenotypic variability in Tunisian familial hypercholesterolemia patients［J］.Atherosclerosis，2012，222（1）：158－166.

［28］CAMERON J，HOLLAøL，RANHEIM T，et al.Effect ofmutations in the PCSK9 gene on the cell surface LDL receptors［J］.Hum Mol Genet，2006，15（9）：1551－1558.

［29］HOMER VM，ARAISAD，CHARLTON F，etal.Identification and characterization of two non-secreted PCSK9 mutants associated with familial hypercholesterolemia in cohorts from New Zealand and South Africa［J］.Atherosclerosis，2008，196（2）：659－666.

（本文编辑：刘斯静）

R543.1

A

1007-3205（2013）04-0490-05

2012－08－14；

2012－09－04

张明明（1976－），女，河北秦皇岛人，河北省人民医院主管检验师，医学博士，从事内分泌代谢疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail：Sguangyao＠sohu.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.04.047