金黄色葡萄球菌肠毒素C的骨科应用研究进展

董晨辉，王子明，王爱民

金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是一种具有极强致病性的人畜共患病病原微生物，已经有100多年的历史［1－2］;金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs)是一类由金黄色葡萄球菌产生的外毒素，属于典型的超抗原。

1 金黄色葡萄球菌肠毒素的超抗原特性及其经食物传播引起的疾病

金黄色葡萄球菌肠毒素(SEs)是属于金葡球菌和链球菌产生的家族庞大的致热肠毒素，由金黄色葡萄球菌编码形成的蛋白质分子，不需要抗原提呈细胞(Antigen-presenting cells，APC)处理而直接与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ)类分子结合，导致带有特异性V节段的CD4+T细胞大量增殖。其对T淋巴细胞的刺激能力是普通抗原的2 000～5 0000倍，在极低浓度时即可产生很强的免疫反应［1－3］。

SEs作为一种超抗原(superantigen，SAg)，对T淋巴细胞具有很强的刺激作用，是目前已知的人淋巴细胞最强的刺激剂和最有力的一种细胞因子诱导剂;它同时是第1个被认识和广泛研究的SAg，也是目前研究最多、临床使用最为广泛的SAg［4］。通过SEC2依赖的细胞介导细胞毒作用，少量的SEC2可以激活大量的淋巴细胞。只要有极低浓度(10～12mmol/L)的SEC2就能与白细胞的MHCII类分子结合，可激活大部分含有T细胞受体β肽链可变区(T cells receptor Vβ，TCR-Vβ)的 T细胞(主要包括 CD4+、CD8+的T细胞)增殖，并使之释放多种细胞因子。这些细胞因子中可能含有具有促成骨效应(osteotropic effects)的生长因子，如具有丝裂效应的胰岛素样生长因子(IGF-I)，成纤维细胞生长因子(FGF-2)和血小板衍生生长因子BB(Platelet-derived growth factor，PDGF-BB)，增加骨细胞活性的转化生长因子TGF-β及骨诱导作用的骨形态发生蛋白BMPs等;Antigen-presenting cells，在细胞免疫反应中，细胞膜结合T细胞抗原受体(T cell antigen receptor，TCR)起着至关重要的作用［4－5］。TCR 是一种糖基化多聚异二聚体，由α、β、γ、δ 4条链构成，抗原与TCR结合，并且与组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)绑定，被抗原提呈细胞(Antigen-presenting cells，APC)发现，与APC细胞膜上的特异蛋白可与超抗原以及T细胞发生非特异性结合，最终刺激免疫细胞的大量生成;这种类型的免疫反应识别存在着高度的专一性，仅有一小部分的T细胞能够识别这种特异抗原。在很大程度上，超抗原能够与T细胞发生很多非特异性反应，而且可以最大限度的激活T淋巴细胞，而且超抗原接受相互反应以及连锁反应的T细胞受体只能识别特异TCR-Vβ和抗原提呈细胞的MHC-Ⅱ型并发生反应［6－7］。

对于抗原提呈细胞来说，SEs受体是MHCⅡ类分子限制分子;有报道显示:金黄色葡萄球菌肠毒素复合物和MHCⅡ类分子必须在T细胞抗原受体的β链上的特异区域结合［8］，这对SE的后续分子水平的研究有着重要的意义。

SE诱导有丝分裂的活性依赖于聚集白细胞介素-6(IL-6)的能力，这与SEs的毒性有着密切的关系。近年来，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒越来越多，据美国疾病预防控制中心相关报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第2位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，研究表明，SEB引起的食物中毒，通常是以牛奶为中间媒介导致食物中毒的发生［9］。多起的金葡球菌引起的食物中毒中，SEA的检出率达到了95%以上，少数查出金黄色等［5－8］;最近的报告显示:蘑菇中的SEA在环境温度121℃中持续28min(或者在128℃持续15min)依然具有生物活性，动物实验中依然可以使动物致病［9－13］。因此，必须加强食品卫生法和食品卫生知识的宣传，加强食品卫生的监督工作，可以有效防止食物中毒的发生。

2 金葡球菌肠毒素C在骨科的应用及前景分析

当今社会的创伤大多伤情严重且失血量大，尤其是失血性休克以及全身多发骨折等严重患者需要尽快输血，改善循环，从而获得近期理想的救治效果。据何静等［14］报道4913例急性创伤患者中，包括60%存在不同程度的骨折。但是骨折的后期治疗相当的复杂，手术的风险评估［15］，特别是老年患者的手术救治。兰秀夫等［16］关于760例骨科老年患者手术风险因素分析中，报道56.7%的骨科老年患者存在不同程度的并发症，术后死亡率为2.1%;在23.3%住院患者术后出现1个或1个以上的并发症，其中包括失血性休克(3例)，肺栓塞(3例)，心肺功能衰竭(5例)以及脑血管意外(3例)和感染(32例)等，这些都是难以避免的临床问题，因此在此研究中，发现一种能够安全应用的骨折损伤修复类用药是很必要的。在金葡素注射液的临床应用中，得到了很多良好的疗效，因此进一步研究其药理机制是必不可少。

在以往的研究中发现，金黄色葡萄球菌(金葡菌)是临床上引起化脓性感染的常见革兰阳性菌，其致病机制与其能分泌多种胞外酶和外毒素有关。有多个二元信号转导系统参与了这些毒力因子的表达调控，其中二元信号转导系统AGR是最重要的表达调控系统。大批学者也在进一步研究这些方面的问题金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)是SEs中特殊的一类，分为SEC1、SEC2和SEC3等几种亚型，这3亚型之间蛋白质分子羧基端存在高度保守，氨基酸的相似度更是达到了95%以上，然而只在2个氨基端略有差。亚型间分子上的关联度与免疫学的关联度相对应．可以推断SEC氨基端决定了亚型间的特异性抗原决定簇，而高度保守的羧基端决定了SEC的生物学活性和亚型间免疫交叉反应的抗原决定簇。

SEs的氨基酸序列的一致性的比较中，基本在22% ～33%，可以推断其功能上也都有其相似之处［17］。可见，SEs的所有成员，享有许多相同的保守结构域，拥有着相似的β-折叠二级结构的模体和一个β-转角模体，两个模体被一个浅沟隔开［9］，而这两个模体之间连接点的序列则存在着高度保守的特性［1，11］，因此，可以推测 SES的致病机理存在共性。近来，应跃斌等［18］利用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术从金黄色葡萄球菌的基因组DNA中克隆SEC2全长基因，PCR产物与pGEM-T载体连接，经测序证实后进行亚克隆，构建其表达载体pET-28a-SEC2，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达成熟重组并纯化rSEC2蛋白后，在对SEC2分子生物学活性以及临床应用上的研究就更加简便快捷。

近年来，研究证实，金黄色葡萄球菌分泌产生的相关蛋白分子质量主要在100ku之下，而SEC2分子质量在28ku左右，一共有239个氨基酸组成的蛋白质小分子［19］;尽管SEs作为一种超抗原的行为模式被广为人知，但是很少有研究表明，SEs是如何穿过肠壁进入机体并且引起一系列的食物中毒事件。利用体外培养技术来研究人类小肠表皮细胞抑制MHCⅡ类分子途径情况下进行金葡球菌毒素的感染，发现表皮细胞有能力促进胞吞SEB和TSST-1的作用，而非SEA。在小鼠的体内试验中看出，通过摄入SEs，血液中SEB的检出率明显远高过SEA;因此，可以得出，金葡球菌肠毒素是可以通过小肠表皮细胞进入机体，并导致严重的临床症状。

在临床应用中，金葡素注射液应用于骨科患者，得到了一定的疗效。全身应用和在骨折断端或骨不连接处局部注射金葡素注射液有利于骨折的愈合，这其中发挥作用的主要成分是SEC2［20］。对于金葡液的主要有效成分的分析研究证明，SEC2在临床治疗肿瘤和其超抗原活性中都表现为主要的作用，因此在SEC2是否能够诱导成骨方面也有待研究证实，但临床应用金葡液治疗骨缺损、骨不连等疾病时，金葡液所表现出的良好效果已经有了很好的例证［18－24］;Wei等［18］制作出羟基磷灰石－纤维蛋白黏合剂-金葡液复合物用于骨缺损模型，结果表明此复合物有很好的塑形作用，可以当成一种新型的骨替代材料用于骨缺损患者的治疗;朱亚军等［23］利用RT联合恩格菲治疗癌症骨转移所致疼痛的效果明显，骨痛分级按VRS分级法，有效率为95%患者(19/20);由于恩格菲主要有效成份是金黄色葡萄球菌肠毒素C2，不仅能直接杀伤肿瘤细胞，并能刺激T细胞的增殖分化，诱发生物学放大效应，导致肿瘤细胞的溶解破坏;余建平等［26］通过将纤维蛋白胶-金葡液复合物植入骨缺损处作为实验组，初步探讨金葡液以纤维蛋白胶为载体修复骨缺损模型，结果从细胞水平的研究发现:金葡液以纤维蛋白胶为载体可以修复骨缺损，能减少金葡液的局部注射缺陷，提高其药物疗效;Tang等［27］研究发现，采用金葡液骨折端注射和谷康泰灵术后肌肉注射，预防发生骨不连，并设同期对照组，结果令人满意。大量骨折后不延迟愈合和骨缺损的患者应用金葡液也得到良好的效果［22－25］。因此，在金葡液成分的分析中，Ding等［28］研究中表明:金葡液中的有效成分中SEC2占主要的地位，并且在疗效上起到决定性的作用。

对于金黄色葡萄球菌肠毒素C2的研究多集中于金葡液为主要方向，金葡液主要通过两种途径加快骨代谢，促进骨的愈合，主要表现为:促进毛细血管增生，改善局部血供;促进成骨细胞分化成熟。然而，金葡液中的主要成分SEC2作用于体外培养的成骨细胞，可显著促进成骨细胞的矿化功能;而主要存在的问题:联合应用抗坏血酸则会有更好的成骨作用，具体的机制仍不详;并且在骨髓间充质干细胞培养发现，SEC2能促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化和成熟，从而达到促进成骨细胞生成，加速骨折的愈合，具体机制仍需进一步完善。因此，SEC2在骨科的应用具有极大地前景，在分子机制上的研究还需要进一步深入研究。

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