GDNF在慢性应激和老化致小鼠行为与认知损伤中的作用*

李 亚，张亚楠，陈亚静，张冠雄，史建勋

（曲阜师范大学生命科学学院，山东曲阜273165）

胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）是神经营养因子家族中主要成员之一，对神经元的生长、增殖、分化、凋亡及轴突的形成等方面具有重要的作用［1］。GDNF在发育期和成年动物的皮层、海马、纹状体及脊髓中均有广泛分布；在不同的发育阶段以及脑内不同部位，GDNF的作用也不尽相同。有研究报道，将人胚胎的神经干细胞植入外伤性脑损伤的大鼠受损海马部位，可引起大量GDNF表达和释放，并明显改善其认知功能［2］。

在脑内，海马和前额叶是最易受应激刺激损伤的脑区，也是与学习记忆功能关系密切的重要区域［3］。研究表明，动物接受强烈的急性应激或长期的慢性应激时，其学习记忆能力显著损伤［4］。本研究采用多因素慢性应激动物模型，检测不同月龄小鼠的旷场行为和空间学习记忆功能的变化，测定不同月龄小鼠脑内海马和前脑皮层神经元GDNF的表达，以探讨慢性应激对小鼠旷场行为和空间学习记忆功能的影响及脑内GDNF的作用。

1 材料与方法

1．1 实验动物和分组

健康昆明品系小白鼠2月龄（青年，体重20～22 g）和 15月龄（老年，体重 40～60 g），清洁级，雌雄各半，山东鲁抗医药股份有限公司动物实验中心提供。将青年和老年小鼠随机分为对照组和应激组。应激组小鼠共接受21 d不同的慢性应激源。采用五种应激方式：足底电击（电压33 V，每隔1 min刺激一次，每次持续 10 s，共 15次）、束缚（1 h／d）、束缚＋热刺激（1 h／d，30℃）、冷水刺激（6℃冷水游泳 3 min）、高台（1 h／d，高 1．6 m）。每天随机选择一种应激方式施加于应激组小鼠。对照组小鼠不接受慢性应激源，以同样的条件饲养。在慢性应激后，对应激组和对照组小鼠进行旷场行为测试和Morris水迷宫试验，并检测小鼠前脑皮层和海马神经元GDNF的表达。

1．2 旷场行为（Open field behavior）检测

旷场行为测试箱高40 cm，底面为50 cm×50 cm的正方形，被均等分成5×5＝25个方格，测试箱上方放置一个60 W的灯光，距离测试箱顶60 cm。实验时，将动物放在中央格内，记录5 min内小鼠跑动的爬行格数（四爪进入的方格数）、直立次数（两前爪腾空或攀附箱壁）、修饰次数（洗脸、抓痒、舔足的次数）和中央格首次停留时间（小鼠被放入中央格直至其四爪跨出该格的时间）。行为评定采用单盲法。

1．3 Morris水迷宫学习记忆能力检测

Morris水迷宫试验程序包括定位航行（Place navigation）和空间搜索（Spatial probe）两部分。水迷宫被均等的分为4个象限，平台置于第Ⅰ象限（目标象限），在水池第Ⅲ象限周边壁上做明显标志物。定位航行试验历时2 d，每只小鼠每天接受8次找平台训练，分两个训练周期（上午和下午），每个训练周期4次，每次对应一个象限将小鼠面向池壁入水，每次训练2 min。记录小鼠寻找到隐藏在水下平台的时间即逃避潜伏期（escape latency）。空间搜索试验在第3天进行，撤除平台，从第Ⅲ象限将小鼠放入水中，记录120 s内小鼠在四个象限的游泳（停留）时间，检测小鼠对原平台（目标象限）的记忆保持能力。

1．4 小鼠海马和前脑皮层GDNF的表达

水迷宫试验结束后，戊巴比妥钠（0．4%）麻醉小鼠，暴露心脏，经心快速灌注生理盐水和预冷的多聚甲醛溶液，前固定；取脑，后固定2 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋后，连续冠状切片（片厚5μm）。切片脱蜡至水，3%过氧化氢水溶液去除内源性酶，98℃抗原修复10 min，免疫组织化学染色按SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）操作说明进行，采用兔抗小鼠GDNF多克隆抗体（编号BA0890），以PBS（磷酸盐缓冲液）代替一抗作阴性对照。每只小鼠选择脑海马CA1区、CA3区、齿状回（DG）和前脑皮层（PFC）切片4张，每片随机选取各区视野，进行显微（×400）拍照。采用Motic Images Advanced 3．2图像处理系统分析测量GDNF的阳性神经元数目。

1．5 统计学分析

数据均以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 13．0软件，水迷宫定位航行试验中的逃避潜伏期进行双因素重复测量的方差分析（repeated-measures ANOVA）；空间搜索试验中各象限游泳时间进行单因素方差分析（one-way ANOVA），组间比较采用Dunnett′s t检验或非配对t检验。

2 结果

2．1 不同月龄小鼠旷场行为的变化

分别与其对照组比较，青年应激组小鼠的爬行格数、直立次数、修饰次数均明显减少（P＜0．05，P＜0．01），而中央格首次停留时间显著增多（P＜0．01）；在老年应激组小鼠，爬行格数、直立次数、修饰次数显著减少（P＜0．05，P＜0．01），中央格首次停留时间明显增多（P＜0．05）。

青年与老年小鼠比较结果显示，老年对照小鼠的爬行格数、直立次数明显减少（P＜0．05，P＜0．01），中央格首次停留时间明显增多（P＜0．05）；老年应激小鼠的爬行格数和中央格首次停留时间有统计学显著性差异（P＜0．05）。结果表明，老年小鼠在新异环境中的自发活动和探究行为的减少，而慢性应激可引起小鼠自发活动和探究行为明显降低（表 1）。

Tab．1 Open field behavior of different ages mice after chronic stress（±s，n＝10）

Tab．1 Open field behavior of different ages mice after chronic stress（±s，n＝10）

*P＜0．05，**P＜0．01 vs control；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs young mice control；△P＜0．05 vs young mice stress

Group Locomotion Rearing Grooming First residence time（s ）Young mice Control 133．30±11．26 36．19±3．06 7．17±1．53 0．96±0．07 Stress 85．23±10．32* 14．67±2．07** 3．62±1．23* 8．63±1．86**Aged mice Control 117．50±10．65＃ 18．56±3．45＃＃ 4．88±1．24 4．17±0．63＃Stress 68．53±9．56**△ 7．17±2．46** 2．16±0．43* 20．50±4．54*△

2．2 不同月龄小鼠定位航行学习能力的变化

重复测量方差分析结果表明，经过2 d的定位航行学习，青年和老年各组小鼠寻找水下平台所需的逃避潜伏期均随时间变化而缩短（图1）；与训练周期（training period）1比较，青年对照组小鼠的逃避潜伏期第2、3、4训练周期显著缩短（均 P＜0．01）；老年对照组小鼠的逃避潜伏期仅在第3、4训练周期明显缩短（均 P＜0．01）。组间比较结果显示，与青年对照组比较，青年应激组小鼠第2、3、4训练周期的逃避潜伏期均有显著性差异（均 P＜0．01）；与老年对照组比较，老年应激组小鼠在第3、4训练周期的逃避潜伏期明显增加（P＜0．05，P＜0．01）。老年对照组与青年对照组相比，在第1、2训练周期的逃避潜伏期有显著性差异（P＜0．05，P＜0．01）；而老年应激组小鼠在第1、3训练周期的逃避潜伏期，与青年应激组比较明显增加（均 P＜0．05）。表明老年小鼠空间学习能力下降；而慢性应激可导致小鼠的空间学习能力明显减退。

Fig．1 Escape latency of different ages mice after chronic stress（±s，n＝10）**P＜0．01 vs training period 1；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs control；P＜0．05P＜0．01 vs young mice control；▲P＜0．05 vs young mice stress

2．3 不同月龄小鼠空间搜索能力的变化

在第3天的空间搜索试验中，青年和老年各组小鼠均在目标象限（第Ⅰ象限）停留的时间最长（图2）。青年对照组和老年对照组小鼠在目标象限停留的时间显著长于在其它三个象限的时间（均 P＜0．01）；而青年应激组和老年应激组小鼠在目标象限停留的时间均无统计学显著性差异（均 P＞0．05）。组间比较结果显示，在青年小鼠，与对照组比较，应激组小鼠在目标象限的停留时间显著缩短（P＜0．01）；老年对照组与老年应激组小鼠比较，在目标象限的停留时间亦有显著性差异（P＜0．05）。老年对照组与青年对照组相比，在目标象限停留的时间显著缩短（P＜0．05）。结果说明，老年小鼠空间记忆能力减退；而慢性应激明显损伤小鼠的空间记忆保持能力。

Fig．2 Swimming time of different ages mice in four quadrants after chronic stress（x±s，n＝10）**P＜0．01 vs quadrantⅠ（target quadrant）；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs control；△P＜0．05 vs young mice control

2．4 不同月龄小鼠脑内GDNF的表达

免疫组化结果显示，在青年和老年小鼠脑内海马的CA1区、CA3区锥体细胞层、DG区颗粒细胞层和前脑皮层，GDNF阳性神经元都有广泛分布。在青年小鼠，与对照组比较（表2），应激组小鼠海马CA1、CA3、DG区与前脑皮层的GDNF阳性神经元数目显著减少（P＜0．05，P＜0．01）；在老年小鼠，与对照组比较，应激组小鼠各个脑区的GDNF阳性神经元数亦显著减少（P＜0．05，P＜0．01）；青年对照组和老年对照组小鼠各脑区GDNF表达的比较结果显示，老年对照组小鼠仅在CA3、DG区和前脑皮层明显减少（P＜0．05，P＜0．01）；而老年应激组小鼠GDNF表达的降低更加显著。结果表明，老年小鼠脑海马和前脑皮层GDNF的表达降低；而慢性应激后脑内海马各区和前脑皮层GDNF的表达显著降低。

Tab．2 Numbers of GDNF positive neurons of different ages mice brain after chronic stress（x±s，n＝10）

Tab．2 Numbers of GDNF positive neurons of different ages mice brain after chronic stress（x±s，n＝10）

*P＜0．05，**P＜0．01 vs control；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs young mice control；△P＜0．05，△△P＜0．01 vs young mice stress

Group CA1 CA3 DG PFC Young mice control 47．12±3．65 60．12±4．23 132．10±7．86 103．58±4．35 Stress 32．23±2．86* 45．78±3．76* 106．64±6．12* 89．02±3．21**Aged mice control 49．26±4．28 51．42±5．23＃ 73．06±5．38＃＃ 92．46±4．26＃Stress 25．58±3．64** 30．13±3．14*△ 53．65±4．21*△△ 48．86±3．27**△

3 讨论

有研究报道，多因素的慢性应激，可引起动物脑内神经递质、神经激素和下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的改变，导致动物行为和学习记忆功能的损害。慢性应激或长期外源性应激激素（糖皮质激素）处理可以引起机体神经精神系统功能失调，导致衰老过程加速，出现学习记忆障碍、痴呆、抑郁等病症［5］，其中对前额叶和海马的选择性损伤是导致这些疾患发生的关键原因。我们先前的研究显示，多因素慢性应激可引起大鼠在旷场行为中的活动减少，并且明显损伤动物的空间学习记忆功能。但亦有慢性复合性应激可增强大鼠的学习与记忆能力的报道；这可能与应激刺激的类型和持续时间等因素不同有关。

海马是学习记忆的重要脑区［6］，也是调节应激反应并受应激影响的重要的脑部结构之一。慢性应激对海马介导的记忆有持久性损伤作用，可能是通过改变海马突触可塑性而影响动物的学习记忆过程［7］。在脑内，应激因素除对海马有影响外，对其它脑区，如前额叶、杏仁核等也有作用［8］。不同应激源可引起机体产生许多与前额叶功能紊乱的神经精神疾病；明显损害大鼠、猴的依赖前额叶的工作记忆能力［9］。本研究结果表明，慢性应激导致小鼠在新异环境中自发活动和探究行为明显减少，空间学习记忆能力显著受损；而老年小鼠的损伤更严重。

GDNF来源于神经胶质细胞，是一种在体内有广泛表达并且作用复杂的多效能神经营养因子，其生物学效应及作用机制倍受关注。GDNF对由各种原因造成的神经元损伤均有保护和修复作用。有研究显示，GDNF及其受体在海马和前额叶皮质都有高度表达，已经明确这些脑区与学习记忆功能密切相关。GDNF基因敲除小鼠表现出海马突触传递效能异常，水迷宫学习任务明显受损。GDNF可使老龄鼠隔-海马系统的胆碱乙酰基转移酶（ChAT）活性增加，该酶与空间学习能力密切相关，而脑室内注射GDNF，可显著改善老龄鼠的空间学习记忆能力。GDNF亦可显著提高老年大鼠的空间学习记忆能力［10］。另有研究表明，GDNF和 GDNF受体（GFR-α1）mRNA的表达水平在出生后随年龄的增长而下降，具有增龄性变化，提示GDNF的变化可能影响神经前体细胞的发育、分化及随年龄的增加而产生的脑老化过程。新生大鼠的海马GDNF mRNA的表达明显上升，生后呈下降趋势。可以推测，衰老过程中较早出现的学习记忆功能的减退与此密切相关；GDNF不但与神经发育、分化有关，也可能参与脑的老化过程。

本研究结果显示，慢性应激后小鼠海马CA1、CA3区、齿状回和前脑皮层GDNF阳性神经元数目明显减少。结果表明，随着年龄的增大，小鼠脑内海马及前脑皮层神经元GDNF表达明显减少；而慢性应激可导致小鼠海马及前脑皮层神经元GDNF的表达显著降低，老年小鼠的改变加重。本研究结果提示，脑的老化和慢性应激导致的小鼠空间学习记忆功能的损伤可能与海马及前脑皮层神经元GDNF表达的变化密切相关。

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