维康颗粒对疲劳型亚健康小鼠免疫功能影响的实验研究

刘艳艳 孙晓敏 欧阳明子 李玉萍 谭 为 程静茹 罗 仁 赵晓山

（1.南方医科大学附属南方医院，广东 广州 510515；2.南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515）

亚健康是目前影响我国公共卫生的重要问题。流行病学调查结果显示疲劳是亚健康状态的最主要表现之一，疲劳型亚健康是亚健康的主要类型[1]。免疫系统是机体最重要的防御器官，与人体健康息息相关，临床很多疾病的发病均涉及到免疫系统异常。目前认为疲劳型亚健康可能存在免疫功能的异常。本实验拟采用临床确切有效的中药复方维康颗粒，观察其干预对疲劳型亚健康小鼠胸腺、脾脏及其T、B淋巴细胞增殖的影响，探讨免疫功能在疲劳型亚健康发生中的作用及维康颗粒干预的药理机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 广东省医学动物实验中心提供的SPF级健康KM小鼠100只，动物质量许可证号：SCXK（粤）2008-0002，雄性，体重 18～22g。

1.2 试剂与药品 实验试剂：刀豆蛋白A、脂多糖购自Sigma公司；淋巴细胞分离液为天津TBD有限公司产品；CCK-8试剂盒为上海碧云天科技有限公司产品；RPMI-1640、胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司。药品：维康颗粒药物（由熟地、淮山药、党参、山萸肉、黄精、陈皮组成，质量比例为8∶4∶4∶4∶6∶3），由南方医院药学部提取制成颗粒剂，规格：10g/包，人用法用量：10g/次，2 次/d，口服。

1.3 主要仪器 Sigma离心机、恒温游泳箱、37℃恒温水浴锅、5%CO2培养箱、净台、酶联免疫检测仪、小鼠饲养盒等。

2 实验方法

2.1 疲劳型亚健康小鼠模型的建立 采用我们已建立的方法造模，即每天强迫小鼠水中站立8h，连续9d制备疲劳型亚健康小鼠模型[2]。

2.2 实验分组与处理 实验前全部小鼠适应性喂养1周，剔除游泳时间及体重差异较大的小鼠，筛选出KM小鼠80只，随机分为4组：正常对照组、疲劳型亚健康模型组（模型组）、维康颗粒干预组及模型自然恢复组，每组20只（其中10只用于力竭游泳测试，10只用于免疫功能和其他指标检测）。实验处理：模型组造模结束后检测有关指标；维康颗粒干预组造模结束后，给予维康颗粒灌胃，剂量为3g/kg，给药体积为20mL/kg，连续7d；正常对照组、模型自然恢复组给予相应体积的生理盐水作为对照，连续7d。

2.3 评价指标

2.3.1 小鼠外观行为学观察 观察实验过程中各组小鼠的精神状态、活动情况、饮食、二便以及爪、鼻、唇、耳等色泽的变化。

2.3.2 疲劳程度测定 以力竭游泳时间测定小鼠疲劳程度。即用7%自身重量的铅坠系于小鼠尾部后，将负重小鼠放入水温25℃的水桶中进行力竭游泳测试，力竭游泳标准为小鼠鼻尖沉入水下10s。

2.3.3 小鼠免疫功能指标 检测实验各组小鼠脾脏及胸腺指数，T、B淋巴细胞增殖能力。

2.4 标本采集与制备

2.4.1 脾脏及胸腺指数 实验结束后（模型组为第10天，其余各组为第17天），将小鼠颈椎脱臼处死，摘取脾脏、胸腺，滤纸吸去表面液体，用电子精密天平称取其质量。脾脏（胸腺）指数=脾脏（胸腺）质量（mg）/小鼠质量（g）。

2.4.2 脾淋巴细胞的制备 实验结束后处死小鼠，迅速将其放入75%乙醇中浸泡3min，超净台下，剪开皮肤和腹壁，剥离脾脏移入盛有hanks’液的培养皿中。取实验前预先准备的15mL离心管（管口覆盖200目尼龙网，经无菌消毒），将脾脏置于筛网上，1mL注射器芯轻轻研磨脾脏，无血清1640小心吹打过滤脾脏，收集脾细胞悬液4mL。另取离心管加入4mL淋巴细胞分离液，吸取4mL脾细胞悬液轻轻加于淋巴细胞分离液上层，勿打乱分离层，离心（2000r/min，15min）后，吸出淋巴细胞层，加入4mL Hanks’液，混匀，离心（2000r/min，10min），吸去上清，沉淀经反复洗2次后，加入RPMI-1640重悬淋巴细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL。

2.4.3 T/B淋巴细胞增殖反应测定 以ConA及LPS为刺激原，分别刺激T、B淋巴细胞引起增殖反应，酶标仪检测其增殖反应能力。具体方法：取1×106个/mL脾细胞悬液100μL于96孔细胞培养板中，12h后再加入含ConA/LPS的RPMI-1640培养液 100μL（ConA终浓度为 5μg/mL，LPS终浓度为10μg/mL），同时设阴性对照（加入不含ConA/LPS的完全培养液 100μL），每份作 3 个复孔。置 5%CO2、37℃孵育 48h，培养结束前 4h，每孔再加入 CCK-8，10μL（5mg/mL），振荡 1min，继续孵育4h。取出培养板，酶标仪上机，450nm测OD值，结果以刺激指数表示。刺激指数SI=刺激孔（加ConA/LPS孔）OD值/对照孔OD值。

2.5 统计学方法 利用SPSS13.0软件进行数据统计分析，结果以（）表示，采用单因素方差分析进行显著性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。组间多重比较，根据方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Tambane’s T2法进行两两比较。

3 实验结果

3.1 小鼠外观行为学改变 模型组小鼠精神倦怠，饮食尚可，体重略降，全身皮毛有浸湿现象，浸湿面积在1/3到2/3之间，皮毛灰暗欠光泽，遗留水盒污渍，逃避反应降低；模型自然恢复组小鼠状态稍好于模型组，体重有所增加，但全身皮毛欠光泽，仍遗留有灰暗污渍。维康颗粒干预组小鼠精神活动自如，体重增加，体型饱满，皮毛恢复光泽；正常对照组未见明显异常。

3.2 各组力竭游泳时间比较 如表1所示。造模后，模型组力竭游泳时间较正常对照组明显减少，有显著性差异；维康颗粒干预组较模型组力竭游泳时间显著增加（P＜0.05），且与正常对照组比较无显著性差异（P=0.764）；模型自然恢复组游泳时间虽较模型组增加，但明显低于维康颗粒干预组及正常对照组（P＜0.05）。提示维康颗粒干预可促进疲劳型亚健康小鼠体力的恢复。

表1 实验各组力竭游泳时间比较

3.3 各组脾脏指数及胸腺指数变化 模型组胸腺指数较正常对照组明显降低（P=0.000）。经维康颗粒干预及自然恢复后小鼠胸腺指数有恢复趋势，但模型自然恢复组仍低于正常对照组（P＜0.05），而维康颗粒干预组则恢复到正常范围，与正常对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。模型组脾脏指数明显低于正常对照组（P＜0.05），维康颗粒干预组的脾脏指数与正常对照组比较无明显差异（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠脾脏及胸腺指数比较

3.4 各组小鼠T、B淋巴细胞增殖反应比较 模型组T、B淋巴细胞经相应刺激原刺激后刺激指数较正常对照组明显下降（P＜0.05，P＜0.01）；而与模型组比较，维康颗粒干预组小鼠 T、B淋巴细胞刺激指数及模型自然恢复组T淋巴细胞刺激指数有明显增加趋势（P＜0.05，P＜0.01），且前者基本恢复到正常水平（P＞0.05），而模型自然恢复组T、B细胞增殖能力虽有所恢复，但仍低于正常对照组及维康颗粒干预组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠T、B淋巴细胞转化增殖反应比较

4 讨论

疲劳型亚健康是以长时间疲劳（即亚疾病性疲劳或亚临床性疲劳）为中心表现的症状群，症状包括疲倦乏力、周身不适、反应适应能力下降等，且需排除由疾病引起的上述表现。本课题组以及国内其他研究人员调查发现，疲劳型亚健康的现患率约为17.6%～50.0%不等[3-4]，研究疲劳型亚健康防治具有非常重要的意义。免疫系统是人体重要的防御系统，具有免疫防御、免疫监视和免疫稳定的功能，在人体健康中发挥着至关重要的作用。胸腺和脾脏作为机体重要的免疫器官，是免疫细胞发育、分化、成熟的重要场所。T、B淋巴细胞作为免疫应答的主要效应细胞，主要参与介导机体的细胞和体液免疫，二者协调作用对维持机体正常免疫功能发挥有重要意义。研究表明身心压力过大、过度劳累、生活作息不规律等因素容易导致机体免疫功能异常[5-7]，而调查结果显示上述因素恰恰与疲劳型亚健康的发生关系密切[8-9]，因此推测疲劳型亚健康应当与免疫功能异常有关。本研究结果表明，疲劳型亚健康模型小鼠的胸腺、脾脏体积减小，重量减轻，胸腺及脾脏指数也显著下降，提示疲劳型亚健康小鼠存在免疫功能下降的情况。进一步通过CCK-8法检测T、B淋巴细胞的增殖能力，发现模型小鼠的T、B淋巴细胞刺激指数明显降低，尤其以T淋巴细胞更为明显，同样证明免疫功能异常与疲劳型亚健康有关。

中医学在疲劳型亚健康的防治方面有独特优势。目前认为情志失调、饮食不节、起居失常、劳倦内伤、年老体衰导致脏腑气血阴阳失调，进而导致疲劳型亚健康的发生。课题组应用中医理论并结合多年临床实践，研制出防治疲劳型亚健康的中药复方——维康颗粒。它由古方六味地黄丸加减化裁而来，可调补脏腑气血，补而不滞，滋而不腻。临床研究证实，维康颗粒干预疲劳型亚健康有显著疗效（总有效率约为93%），且安全性好[10]。同时药理研究表明，熟地、山药、党参等药物的提取物多糖可以提高实验动物的免疫功能[11-12]。本次实验中，我们发现维康颗粒不仅可以缓解模型小鼠的疲劳状态，还可以提高小鼠的脾脏及胸腺指数，增强T、B淋巴细胞的增殖能力，从而增强模型小鼠的免疫功能状态，且其干预效果优于模型自然恢复组，提示维康颗粒在干预疲劳型亚健康，纠正其免疫功能异常方面有确切疗效。

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