益骨口服液对去势大鼠骨质疏松症血瘀病机微观分子的影响

朱胤晟 姚新苗 吕一

（1.浙江中医药大学第三临床医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学附属第三医院，浙江 杭州 310005）

骨质疏松是以骨量丢失，骨组织显微结构退化为特征，以致骨的脆性增加及骨折危险性增加的一种全身性骨骼疾病[1]。前期实验我们已证实益骨口服液能促进成骨细胞（OB）的增殖。中医认为“肾虚”与“血瘀”是骨质疏松症的主要病机，因此设计本实验从血瘀的角度，通过对血浆内皮素（ET）、血小板膜糖蛋白CD62p、CD63指标的观察，研究益骨口服液对骨质疏松症模型大鼠血瘀病理状态的干预作用，观察补肾活血方益骨口服液在补肾益骨的基础上还可能具有的活血化瘀功效。

1 实验材料与方法

1.1 药物和器材 益骨口服液（由补骨脂10g，骨碎补15g，生地 15g，仙灵脾 15g，淮山药 15g，丹参 30g组成），制成浓缩水提液，含生药量1.0g/mL，用于大鼠灌胃治疗，由浙江省中医院中药房提供。氯氨酮，上海第一生化药业有限公司生产，批号沪卫药准字（1995）第 001064号。大鼠内皮素（ET-1）酶联免疫检测试剂盒，美国R&D公司生产。试剂单抗CD62p-PE、CD63-FITC，由Biopool生物有限公司提供。ELITE型流式细胞仪：采用美国贝克曼库尔特公司生产。密盖息：瑞士诺华制药有限公司，注册证号：H20090459。

1.2 实验动物 5月龄雌性SD大鼠80只，体重（200±10）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，实验动物合格证号：SCXK（沪）20080016，常规饲料喂养，自由饮水。饲养室保持良好通风，控制室温在（21±1）℃，湿度 63%，噪音＜55 分贝，光照与黑暗时间为每12h交替。

1.3 造模 以氯胺酮按0.1g/kg腹腔麻醉后，行双侧卵巢切除手术。术后3d肌注青霉素4×10U，预防感染。

1.4 给药 造模术后将SD大鼠以常规饲料喂养12周，第13周起开始每日给药。益骨口服液组予益骨口服液10mL/kg，含生药量1.0g/mL，每日2次灌胃；密盖息组予密盖息1.04U/kg肌肉注射，每周治疗2次；益骨口服液+密钙息组，用量用法同上2组；生理盐水对照组予生理盐水10mL/kg，每日2次灌胃。各组均给药90d。

1.5 观察指标

1.5.1 血浆内皮素含量测定 采用酶联免疫法测定，在末次给药后禁食12h，从腹主动脉取血，注入含10%EDTA二钠30μL和抑肽酶 20μL的试管中， 混匀，4℃，300r/min离心10min，分离血浆，置于-20℃保存，分批测定。

1.5.2 血小板膜糖蛋白CD62p、CD63含量测定 采用单克隆抗体流式细胞术检测。具体方法如下：取血，抗凝，800r/min离心5min，取上层富含血小板的血浆（PRP），3500r/min离心15min，弃上清，加入 PBS 2mL，3000r/min 离心 10min，洗涤 2次，用1%多聚甲醛1.5mL室温固定30min。将固定后的血小板悬液2500r/min离心10min，弃上清，分别加入荧光标记的CD62p、CD63特异性抗体 2mL，置室温 30min，2500r/min离心10min，弃上清，加入1mL PBS将血小板悬浮。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件包分别对数据进行统计学处理，计量资料以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

各组大鼠治疗后血浆内皮素，血小板膜糖蛋白CD62p、CD63的含量变化见表1。

表1 各组大鼠治疗后血浆内皮素、CD62p、CD63含量（） ng/L

表1 各组大鼠治疗后血浆内皮素、CD62p、CD63含量（） ng/L

注：与生理盐水对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与密盖息组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；

3 讨论

骨质疏松症可导致因骨的脆性增高而骨折，骨折不可避免地会损伤血窦，致骨内瘀血。由于容积增加而使骨内压升高，导致骨痛。以往对骨质疏松症的治疗以肾主骨为根本指导思想，对本病的认识也多停留在补肾这一单一层面上[2]。而现代认为骨质疏松症是在肾虚的基础上导致血瘀，尤其重视了瘀血在骨质疏松症病因病机中的作用[3]。而血瘀证的本质与微循环障碍密切相关，虽然目前国外文献尚未报道关于血瘀的概念，也无法从血瘀来探讨原发性骨质疏松，但有很多文献报道了对原发性骨质疏松与微循环改变关联的研究[4]，这些微观改变与中医学血瘀证分子生物学研究有极大的相关性。认为血瘀的形成与血液成分、血流状态、血管壁等病理变化密切相关[5]。

中医认为血的运行必须依赖气的推动，气虚无以推动血行必定成瘀，表明血瘀证除了与“血行”有关外，还与血液本身成分的改变有关。目前血小板活化因子是血瘀证血液成分改变的研究热点[6]。近年研究认为，CD62p、CD63都是活化血小板膜糖蛋白，分别存在于静息血小板的a-颗粒内及溶酶体膜，当血小板被激活时，血小板内颗粒与血小板膜整合，CD62p、CD63表达于血小板表面，是目前所知的反映血小板活化与释放反应最特异性的标志物。内皮细胞的存在为维持血液的流动状态所必需，它的损伤是血管病变的始动因子。近年发现的低分子ET，是具有细胞信使样作用的生活活性物质。通过实验证实ET对微循环血管的功能和结构，对血细胞的聚集和黏附都有显著的影响，已被视为血瘀证严重程度的指标[7]。

本实验结果显示：在给药90d后，与生理盐水对照组比较，益骨口服液能降低去势大鼠血浆血小板膜糖蛋白CD62p、CD63的水平，降低血浆内皮素的含量。通过对血管内皮细胞功能及血小板膜糖蛋白的检测，从微观分子生物学角度，说明补肾活血方益骨口服液能改变骨质疏松“血瘀”病理状态下的客观性变化。

到目前为止，关于血瘀与骨质疏松症直接相关的系统研究很少，笔者认为，中医药复方研究防治骨质疏松症，应综合运用多靶点、多途径的研究渠道[8]。本研究是以内皮素和血小板膜化蛋白为突破点，从“血瘀”立论，丰富了“肾虚”致病理论，从“血瘀”的病理本质出发，对以后更深入研究中医补肾活血法治疗骨质疏松症提供理论及实验依据。

[1]刘忠厚.骨质疏松学.北京：科学出版社，1998：529

[2]张鑫，肖鲁伟，童培建，等.补肾活血汤防治绝经后骨质疏松症的实验研究.中国正骨，2010，2（22）：83

[3]杨林，姚新苗，黄竞，等.补肾益骨方对去势大鼠血生化、骨量和骨力学性能的影响.中国骨伤，2007，4（22）：224

[4]眭承志，陈少玫，程火生，等.绝经后骨质疏松症血瘀病机的微观分子生物学论证.中医研究，2005，4（18）：21

[5]吴其夏.体液因素和血液循环病理生理学.北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1991：126

[6]眭承志，范燕妮.老年性骨质疏松血瘀病机的微观分子生物学研究.中国骨质疏松杂志，2010，5（16）：325

[7]王静，张兰，张家庆，等.雌激素对血浆内皮素水平的影响.中华内分泌代谢杂志，1996，12（1）：46

[8]黄宏兴，陈彦东.中西医结合防治骨质疏松症的研究思路和方法.中医正骨，2008，20（3）：74