多巴胺受体（DR2）激活对乳鼠心肌细胞缺氧／再灌注损伤的保护作用及其机制*

魏 璨，高 君，陈爱东，白淑芝，李宏霞，柳 磊，邵洪江，彭 雪，李梅秀，徐长庆△，李鸿珠△

（1.哈尔滨医科大学基础医学院病理生理学教研室，黑龙江哈尔滨150086；2.哈尔滨市第一医院骨一科，黑龙江哈尔滨150010；3.牡丹江医学院红旗医院，黑龙江牡丹江157011）

在原发性心脏病中，缺血性心脏病的发病率居首位，其中50%以上都是由心肌缺血／再灌注损伤（myocardial ischemia／reperfusion injury，MI／RI）所引起［1］。大量的动物实验研究已发现，MI／RI的发生与细胞凋亡密切相关［2］，缺血／再灌注后心肌细胞凋亡明显增加，那么减少心肌细胞凋亡，则对减轻心肌损伤具有重要的意义。

多巴胺受体（dopamine receptor，DR）属于七个跨膜区域组成的G蛋白偶联受体家族［3］，主要分布在中枢神经系统，在外周主要分布于肾脏、肠系膜、心脏、血管等。当今国内外对于DR的研究多集中在精神分裂症、帕金森病、药物依赖、胃溃疡等，心血管系统主要涉及多巴胺对高血压、充血性心力衰竭等的影响。DR对MI／RI的影响，国内外尚未见报道。我们在前期研究中发现，大鼠离体 MI／RI过程中DR1和DR2的表达是增加的［4］，且在模拟的原代培养乳鼠 MI／RI模型中，DR1激动剂（SKF-38393）可上调线粒体和死亡受体途径，促进 MI／RI和细胞凋亡［5］。有报道，多巴胺D2受体激动剂培高利特能减轻脑缺血／再灌注时海马神经元的凋亡［6］。我们采用原代培养乳鼠心肌细胞缺氧／再灌注损伤模型，探讨DR2激动剂是否在MI／RI诱导的细胞凋亡中发挥类似作用，以便为缺血性心脏病的防治提供新思路和新靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar乳鼠（2～3 d，雄性，8～15 g），由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂

溴麦角环肽（bromocriptine，Bro）和氟哌啶醇（haloperidol，Hal，Sigma），Western及 IP细胞裂解液（beyotime），DMEM培养液（Hyclone），RT-PCR试剂盒（Promega），LDH、SOD、MDA测定试剂盒（南京建成），Annexin-V凋亡检测试剂盒（北京宝赛）等。

1.3 主要器材

高速低温离心机（Beckman），US-640型紫外分光光度计（Beckman），倒置相差显微镜（Olympus），Western blot电泳槽（美国 BIO-RAD），培养箱 MCO-17AICO2（SANYO），S-1300-U净化工作台，PCR仪PTC-100（美国）等。

1.4 原代心肌细胞培养

用70%的酒精浸泡消毒Wistar乳鼠，开胸取心，D-Hank’s液清洗2次，剪碎放入10 ml离心管中；加入心肌5倍体积的0.25%胰酶，37℃水浴消化12 min，共消化4～5次；除第一次外，每次收集的细胞悬液，放入等体积的高糖DMEM培养液终止消化后，1 500 r／min离心 15 min，弃上清，用含 10%胎牛血清的高糖DMEM培养液将沉淀吹打为单细胞悬液，经200目筛网过滤去除未消化组织块。用差速贴壁分离法去除成纤维细胞，将纯化心肌细胞计数后，以 5×106cells／cm2接种于培养皿中，37℃、5%CO2条件下孵育培养。隔天换液，取第4天的细胞进行实验。

1.5 心肌细胞缺氧／再灌注损伤模型的建立及分组

1.5.1 模型建立 参照文献［7］，将高纯度氮气（N2）通入低糖DMEM中饱和30 min，驱除氧气，取生长4 d的单层心肌细胞，换用 N2饱和的低糖DMEM培养液，放入5%CO2的37℃孵箱中培养2 h；再将缺氧后心肌细胞的培养液换为含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液培养24 h。

1.5.2 实验分组 培养的乳鼠心肌细胞随机分为4组（n＝10）：（1）正常对照组（Control）：正常细胞培养，不做任何处理；（2）缺氧／再灌注组（H／R）：按照上述方法缺氧 2 h，复氧 24 h；（3）激动剂干预组（Bro）：同上，在复氧时加入 Bro（10μmol／L）；（4）抑制剂干预组（Hal）：复氧时加入 Hal（10μmol／L）。

1.6 形态学观察及细胞凋亡检测

1.6.1 倒置显微镜 在倒置显微镜下，肉眼观察不同培养时间、不同因素处理后乳鼠心肌细胞的形态变化。

1.6.2 透射电镜 用0.25%胰酶消化细胞 4 min，PBS洗涤1次，2 000 r／min离心 10 min后弃上清收集细胞；4℃，2.5%戊二醛固定；1%锇酸固定，常规乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铅铀双重染色，透射电镜下观察心肌细胞的超微结构并摄片。

1.6.3 Annexin-V染色检测凋亡率 取各组心肌细胞，0.25%胰酶消化，PBS洗涤2次后调整细胞密度为1×106cells／L，制成单细胞悬液；加入由 100μl Binding Buffer和 FITC标记的 Annexin-V（20μg／ml）10 μl，室温避光 30 min；加入 PI（50μg／ml）5μl，避光 5 min；加入400μl Binding Buffer，立即用流式细胞仪（FACScan）进行定量检测。

1.7 LDH和SOD活力以及 MDA水平的测定

取各组细胞的培养液，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度：标准品为牛血清白蛋白；按试剂盒说明书操作；紫外分光光度计上读出吸光度（OD）值，计算细胞的LDH和SOD活力以及MDA水平。

1.8 RT-PCR检测细胞凋亡相关蛋白的mRNA水平

1.8.1 心肌细胞总RNA提取 用 Trizol法提取心肌细胞总RNA，用A260和A280判断RNA纯度及含量。

1.8.2 DNase I酶处理 RNA RNA 15μl；DNase I 1 μl；10×DNase Ibuffer 5μl；DEPC-H2O29μl；37℃水浴30 min后加入Trizol reagent、氯仿重新提取总RNA。

1.8.3 逆转录（RT） 反应 AMV逆转录酶逆转RNA，合成第一链 cDNA，取 RNA 5μl，Oligo dT 1μl，DEPC-H2O 4.5μl，总体积为 10.5μl。70℃水浴 10 min后置于冰上，放入-20℃冰箱保存。

1.8.4 聚合酶链反应（PCR） 依据文献设计Bcl-2、Fas、Fas-L、caspase-3、caspase-8和 caspase-9的引物（表1）。引物扩增条件：首次循环为94℃3 min；随后进行 30次循环：94℃ 30 s，58℃40 s，72℃ 1 min；进行10次循环后加入β-actin，72℃终延伸5 min。

Tab.1PCR-primer sequences

1.8.5 PCR产物分析 取8μl产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下拍照，分别用Bcl-2、Fas、Fas-L、caspase-3、caspase-8、caspase-9与β-actin扩增条带的信号面积之比判断其mRNA水平。

1.9 Western blot检测蛋白表达情况

取各组心肌细胞，PBS洗涤后加入全细胞裂解液，冰浴 10 min，4℃，12 000 r／min离心 15 min，取上清进行蛋白质定量。取50μg蛋白样品于10%SDSPAGE凝胶电泳；随后转印于PVDF滤膜上，用5%脱脂奶粉，37℃封闭1 h；用封闭液稀释一抗，4℃震荡过夜；TBST稀释二抗（1／2 000的羊抗兔IgG二抗，碱性磷酸酶标记），室温振荡孵育2 h；最后显色，凝胶成像系统下拍照，计算条带光密度值，蛋白表达水平以其与β-actin光密度比值来表示。

1.10 统计学分析

实验数据以均值 ±标准差s）表示，采用SPSS10.1软件进行统计分析，采用方差分析及配对t检验判断其差异显著性。

2 结果

2.1 倒置显微镜下细胞形态学变化

正常心肌细胞原代培养4～6 h后开始贴壁生长，由圆形变为梭形或多角形，胞核小，胞浆致密；培养24 h后，细胞呈团簇状并同步节律性收缩。取培养4 d的细胞进行分组实验。正常组细胞继续培养，细胞生长情况良好；H／R组可见心肌细胞皱缩，生长分散，心肌细胞收缩节律不规则，贴壁细胞变圆，部分脱落；加药孵育24 h后，Bro组心肌细胞形态及收缩性等较H／R组有所改善；而 Hal组则变化不显著（图 1）。

Fig.1 Morphological changes of neonatal rat cardiomyocytes by inverted microscope（×100）

2.2 透射电镜下各组心肌细胞超微结构改变

正常组：核膜清楚，线粒体结构完好；H／R组：细胞核固缩，染色质高度凝聚、边缘化，线粒体肿胀和空泡化；Bro组：核膜结构较完好，染色质部分凝聚，少量线粒体空泡化；Hal组：细胞核固缩，染色质凝聚、边缘化，线粒体空泡化（图2）。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率

正常组：心肌细胞少量凋亡；H／R组：心肌细胞凋亡率明显增加（P＜0.01与对照组比）；Bro组：心肌细胞凋亡率明显低于 H／R组（P＜0.01）；Hal组：心肌细胞凋亡率与H／R组没有显著差异（P＞0.05，图 3）。

Fig.2 Ultrastructure of cardiomyocytes by transmission electron microscopy（×10k）

Fig.3 Apoptosis rate of cardiomyocytes by FCM（n＝4）

2.4 各组LDH、SOD活性和MDA含量的变化

（1）与正常对照组比较：H／R组 LDH活性、MDA含量明显增加，SOD活性显著降低（P＜0.01）；（2）与H／R组比较：Bro组LDH活性、MDA含量降低，SOD活性增加（P＜0.01）；Hal组上述指标变化不明显（P＞0.05，表 2）。

Tab.2 Changes of LDH and SOD activity and MDA content in cell medium（¯x±s，n＝10）

2.5 RT-PCR检测各组心肌细胞凋亡相关因子mRNA水平

按 Trizol提取心肌细胞总 RNA，测定 OD260／OD280值为1.84，符合实验标准。RT-PCR的检测结果分别以各凋亡相关因子与β-actin扩增条带的面积比表示：（1）与正常组相比，H／R组所有凋亡相关因子表达均增加（P＜0.01）；（2）与 H／R组比较，加入Bro后除Bcl-2表达增加（P＜0.01），其它因子表达都降低（P＜0.05，P＜0.01）；加入 Hal对上述指标影响不显著（P＞0.05，表 3）。

2.6 Western blot检测各组心肌细胞凋亡相关因子蛋白水平

以凋亡相关因子与β-actin蛋白条带面积之比作为观察参数，各组凋亡相关因子的表达规律与上面mRNA的转录规律一致（表4）。

Tab.3 Results analysis of mRNA expression of the factors in cell apoptosiss，n＝6）

Tab.3 Results analysis of mRNA expression of the factors in cell apoptosiss，n＝6）

H／R：Hypoxia／reperfusion；Bro：Dopamine receptor（DR2）agonist；Hal：DR2 antagonist**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs H／R group

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Tab.4 Results analysis of protein expression of the factors in cell apoptosiss，n＝4）

Tab.4 Results analysis of protein expression of the factors in cell apoptosiss，n＝4）

Cyt C：Cytochrome C**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs H／R group

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3 讨论

本实验通过乳鼠心肌细胞缺氧／再灌注模拟MI／RI，采用多种方法检测心肌细胞损伤和凋亡情况，并观察DR2激动剂和抑制剂对心肌细胞缺氧／再灌注所致损伤的作用并探讨其机制。

倒置显微镜和透射电镜观察显示，原代培养的乳鼠心肌细胞在缺氧／再灌注后出现贴壁细胞变圆，部分脱落；细胞核固缩，染色质凝聚，线粒体肿胀和空泡化；同时，细胞培养液LDH活性增强。这些均表明缺氧／再灌注导致心肌细胞发生明显的损伤。

LDH外漏程度可反映细胞受损程度；SOD活性可反映机体清除自由基和抗脂质过氧化的能力；MDA含量可反映氧自由基产生和组织的损伤程度。本研究显示，与正常对照组相比，缺氧／再灌注组培养液中MDA含量明显增加、SOD活性显著降低，表明缺氧／再灌注性心肌损伤与自由基生成增多有关。

大量动物实验和临床研究证明，缺血／再灌注心肌存在细胞凋亡［2］。心肌缺血／再灌注时，钙超载、氧自由基大量产生、ATP耗竭等，可触发细胞凋亡的发生［8］。细胞凋亡的发生可经外部的死亡受体途径及内部的线粒体途径。Caspase-3是细胞凋亡的关键蛋白酶，其活化是凋亡级联反应关键步骤［9］。上述两条途径都是通过激活 caspase-3执行凋亡过程。抗凋亡蛋白Bcl-2可抑制 Cyt C释放和 caspase激活，进而阻断凋亡发生［10］。

Annexin-V是目前检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。本实验的流式细胞仪分析结果显示：缺氧／再灌注后心肌细胞凋亡率约增加3倍。同时，RTPCR和Western blot的检测表明，缺氧／再灌注组Cyt C、caspase-3、caspase-8、caspase-9、Fas和 Fas-L mRNA和蛋白表达均明显增加，这就进一步证实上述结论。至于Bcl-2表达增加，可能是机体的一种代偿性适应性反应。

我们前期研究发现，在 MI／RI过程中 DR1和DR2的表达增加，DR1激动剂可上调线粒体和死亡受体途径，促进 MI／RI和细胞凋亡［4-5］。DR2的活性变化对MI／RI的影响，国内外尚未见报道。

Bromocriptine（Bro）是 DR2的激动剂，Haloperidol（Hal）是DR2的抑制剂。本实验倒置显微镜、透射电镜、流式细胞仪和生化检测结果均显示：Bro可减轻并抑制心肌缺氧／再灌注诱导的心肌细胞损伤和细胞凋亡以及增强机体的抗氧化能力；而Hal则无明显影响。分子生物学检测结果显示，加入Bro可下调促凋亡因子表达而上调抑凋亡因子Bcl-2表达。

综上所述，DR2激活可减轻缺氧／再灌注对心肌细胞的损伤，其机制与清除自由基、减少脂质过氧化和通过Cyt C-caspase-3线粒体途径和Fas／Fas-L死亡受体途径抑制心肌细胞凋亡有关。结合我们的前期实验结果，激活心肌DR2和抑制DR1有望为缺血性心脏病的防治提供一个新思路和新靶点。

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