视黄酸和三碘甲腺原氨酸在减轻睡眠剥夺损害认知功能中的作用*

张 娜，马 强，陈学伟，徐传香，安改红，崔 博，佘晓俊

（军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津300050）

当前，随着社会的发展，生活节奏的加快，工作模式的转换和工作压力的增大，越来越多的人们处于一种潜在的睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）状态。持续性工作状态所导致的SD对人的认知功能及工作能力的影响，一直是现代预防医学及许多行业（如航空、航海、救援、运输、医疗等）所关注的问题。有研究显示，24 h的SD使人的认知能力下降30%～40%，持续48 h，认知能力下降达60%～70%［1］。

神经颗粒素（neurogranin，Ng）是神经元特异性的突触后膜蛋白，在脑内主要分布于海马、前额皮层、纹状体和杏仁核等与认知功能高度相关的重要脑区［2］。大量研究报道，Ng是参与调控学习记忆过程的一个重要蛋白，参与了学习记忆过程中起核心作用的信号转导以及突触可塑性的主要调控环节［3］。前期实验发现，Ng在SD损害认知功能过程中可能发挥重要作用［4］。上调Ng的表达有可能减轻 SD对认知功能的损害。

维生素A（vitamin A，VA）是人体必需的重要微量营养素，它在人体的视觉、免疫、生长发育及细胞分化等方面发挥着广泛的生理学效应。甲状腺激素（thyroid hormones，TH）具有维持正常生长发育、促进代谢和产热、提高神经兴奋性的作用。最近，有报道VA的活性代谢物-视黄酸（retinol acid，RA）和TH的活性形式-三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）与海马突触可塑性和认知功能相关。进一步研究发现，RA和T3可通过其相应的核受体调控Ng基因的表达［5］。因此，本研究观察在72 h SD时补充RA或T3能否通过上调Ng的表达进而有效减轻SD对认知功能的损害，为寻找预防或缓解SD损害认知功能的有效措施提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性Wistar大鼠24只，体质量180～220 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，给予12 h光照／12 h黑暗（光照时间为 6∶00～18∶00），自由饮食及进水，饲养室的温度 （18～24℃）和湿度 （55%）相对较为恒定。大鼠适应环境1周后，实验动物随机分为4组（n＝6）：即72 h对照组（72 h C组），72 h睡眠剥夺＋生理盐水组（72 h SD组），72 h睡眠剥夺＋RA组（72 h SD＋RA组）和72 h睡眠剥夺＋T3组（72 h SD＋T3组）。

1.2 动物模型

睡眠剥夺箱［6］由两个60 cm×20 cm×60 cm有机玻璃箱组成，底部通过一个直径为46 cm的转盘相连。转盘转速为每圈10 min，SD侧的转盘下底盘中水深2～3 cm，水温保持在20℃左右，大鼠只能在转盘上活动，瞌睡时转盘和箱侧壁会将其挤下水中，从而达到SD的目的；对照组一侧的转盘下底盘中不放水，大鼠可以在转盘上和底盘中自由活动，保证正常睡眠。其间自由进食、饮水，自然昼夜光照。每次将两只大鼠称重后放入睡眠剥夺箱的两侧，一侧为SD组，另一侧为对照组。干预组的大鼠于SD前一天开始腹腔注射 RA或 T3（150μg／kg），1次／天，持续4 d。

1.3 旷场实验

实验装置为高50 cm，底边为100 cm×100 cm的无盖方箱，底面平均分为25个方格。旷场实验中，将大鼠置于方箱底面中心，记录大鼠3 min内在箱底的穿行格数和直立次数。两次实验之间清洗方箱周壁及底面，以免上次动物余留的信息影响下次实验结果。

1.4 海马齿状回LTP诱发实验

大鼠用 20%乌拉坦腹腔注射（1.5 g／kg），待动物麻醉后，固定于脑立体定位仪上，常规手术暴露颅骨，记录电极定位于海马的齿状回颗粒细胞层（前囟后 3.5 mm，中缝旁 2.0 mm，硬脑膜下 3.5 mm）；刺激电极定位于同侧海马穿行通路上（前囟后8.0 mm，中缝旁4.0 mm，硬脑膜下3.0 mm）。实验开始时，先用中等刺激电压的单刺激（interval＝30 s，duration＝200μs）诱发齿状回产生群峰电位（population spike，PS），记录至少30 min，使PS幅值达到稳定。调节刺激电压，使PS幅值达最大值，再下调刺激电压，使PS保持在其最大峰值的50%，固定此刺激电压。用单刺激，记录每5 min内引出10个PS的平均值，共记录30 min。然后，用高频刺激（high frequency stimulation，HFS）：2 s内 10次 internal＝5 ms，duratio n＝200μs，trains＝5的复合串刺激，诱发 LTP。HFS之后，再用HFS前的单刺激，记录每5 min内PS的平均值，共记录60 min。以HFS前5min内的PS均值为100%，HFS前后各时间点记录的PS均值与之比较，以百分数（%）表示。

1.5 Western blot检测海马Ng的蛋白表达

海马称重后置于脑组织蛋白提纯缓冲液中（20 mmol／L Tris-Hcl pH 7.0，1 mmol／L EDTA，1%Triton-100，0.5%PMSF）低温匀浆，14 000 r／min离心 15 min，取上清，用BCA法测蛋白含量并分装，-20℃保存，用于Western blot检测Ng表达。将提取的脑组织蛋白（10μg）加2×SDS上样缓冲液（总体积为10 μl）经95℃变性10 min；上样于10%SDS聚丙烯酰胺（Sigma）凝胶中电泳 1.5 h；用半干转膜仪（北京六一）将蛋白转到 PVDF膜（millipore）上，约 60 min。10%脱脂奶粉溶液于室温封闭1 h，TBST漂洗3次×10 min；加入羊抗人 Ng抗体（1∶500，Santacruz）室温1 h后 4℃过夜，TBST漂洗 3次 ×10 min；加入HRP-抗羊 IgG（1∶5 000，Santacruz）室温孵育 1 h，TBST漂洗3次×10 min；加ECL发光显色剂，暗室内压片（Kodak）；用洗脱缓冲液洗PVDF膜30 min。同法显示HRP标记的GAPDH单克隆抗体（1∶10 000，上海康成）。

1.6 数据处理

所有数据以均数±标准差（s）表示，统计处理用SPSS 13.0软件进行分析，各组采用单因素方差（one-way ANOVA）分析进行组间比较。

2 结果

2.1 RA和T3干预对72 h睡眠剥夺大鼠旷场行为的影响

旷场实验中，72 h SD后，大鼠站立次数有降低趋势，穿行格数显著降低（P＜0.05）。腹腔注射RA和T3的大鼠较SD组站立次数有增多趋势、穿行格数显著增加（P＜0.05），接近C组的水平。提示RA和T3可以使72h SD大鼠自发行为和探究活动增加，缓解了神经系统的抑制状态（图1，2）。

2.2 RA和T3干预对72 h睡眠剥夺大鼠海马齿状回LTP的影响

高频刺激前，各组的PS峰幅值无显著性差异（P＞0.05）。高频刺激后，PS峰增加幅值均明显升高，出现LTP。与C组比较，SD组的PS峰升幅较小（P＜0.05，P＜0.01），腹腔注射 RA和 T3的 SD组，PS峰升幅较SD组显著增高（P＜0.05），并且与C组无显著性差异。C组、SD组、SD＋RA组和SD＋T3组的 PS峰幅值分别为171.8%±14.7%，142.2%±5.7%，158.6%±8.1%和 166.1%±9.3%（图 3）。

Fig.1 Effects of RA and T3 on the rearing number in open field test after 72 h SD in ratss，n＝6）

Fig.2 Effects of RA and T3 on the crossing number in open field test after 72 h SD in ratss，n＝6）

Fig.3 Effects RA and T3 on the LTPin DGof rats after 72 h SD in rats（n＝6）

2.3 RA和T3干预对72 h睡眠剥夺大鼠海马Ng蛋白表达的影响

Western blot结果见图4。72 h SD＋RA组和72 h SD＋T3组大鼠海马Ng蛋白表达水平较72 h SD组显著升高（P＜0.05），均与C组无显著性差异（图5）。表明腹腔注射RA和T3可以有效上调SD后海马中下降的Ng蛋白水平。

Fig.4 Western blot analysis of Ng levels in the hippocampus of rats

Fig.5 Effects of RA and T3 on hippocampus neuronal Ng protein expression after 72 h SD in ratss，n＝6）

3 讨论

大量研究表明，SD使机体认知功能明显受损，如学习、记忆能力下降，反应迟钝，注意力分散，定向障碍，出现幻觉［7，8］等，但其具体的机制尚未完全阐明。前期研究发现，Ng及其PKC信号转导途径有可能是SD损害认知功能的重要机制之一，SD可能通过影响中枢海马中以Ng为上游调控子的信号转导通路，进而损害机体的学习记忆功能［4］。据此，有可能定位进行干预调控的有效作用靶点，预防和减轻SD对认知功能的危害。

VA是一种有着广泛生理学和药理学活性的重要微量营养素，在体内主要通过其活性代谢产物RA调节其核受体而发挥作用。有研究显示RA不仅在中枢神经系统（central nervous system，CNS）的发育中发挥重要作用，而且在成人CNS中也发挥重要作用［9］。海马中RA含量在大脑各区位居首位，是RA合成活力非常强的区域。

RA主要通过两大类视黄酸受体（retinoic acid receptors，RAR）（a，β，γ）和 （retinoid X receptors，RXR）（a，β，γ）调控靶基因表达。这些受体是 DNA结合蛋白，被特殊的类维生素A配体激活后，通过与靶基因特异的启动序列相互作用引起基因的转录。在许多表达受RA调控的基因中，有一些编码自身的核受体，有一些编码在突触可塑性中起重要作用的脑特异性蛋白质—Ng［10］。基因敲除实验表明这些受体和某些编码神经蛋白（如Ng）的基因在海马LTP形成中起重要作用。有研究发现在成年啮齿类动物中，随着年龄的增长或者食物中VA被剥夺，RAR表达水平明显下降，而RAR的低表达可使Ng mRNA及Ng蛋白表达水平明显下降。外源补充RA则可以减轻因衰老或VA缺乏引起的记忆功能减退，并且可以逆转RAR低表达状态，进而提高Ng mRNA及Ng的表达。Ling L等研究发现外源性补充RA可以通过上调Ng mRNA和蛋白的表达，使脑梗塞的缺血面积明显减少，促进神经功能恢复，发挥神经保护作用。

TH具有多种生理作用，它调节着机体正常的行为、认知和神经系统的发育，对哺乳动物的脑发育及其功能成熟具有广泛而重要的影响。研究发现，甲状腺功能紊乱会影响动物海马发育期的突触功能，并且损害甲状腺功能正常的成年动物学习记忆功能。对甲状腺切除的成年鼠进行电生理和生化的研究表明，由TH缺乏造成的记忆损伤与海马CA1区的LTP损伤有关。TH常常控制着多种基因的表达，这些基因又调控着突触可塑性和记忆形成的各种形式。

JMunoz等筛选大鼠脑的cDNA文库时发现一个在TH缺少时mRNA水平明显降低的神经特异性基因—Ng［11］。TH对哺乳动物大脑的发育有重要的调节作用，而Ng基因是首个被发现由于缺乏TH而在mRNA水平的表达发生显著改变的神经细胞基因。在发育的关键时期，Ng的基因表达受TH调节，TH能够影响Ng蛋白在神经元内的最后积聚量，但不影响其基因的表达方式，且这种调节是可逆的。甲状腺机能减退的大鼠，脑组织内的Ng mRNA表达水平明显下降，这一变化可被外源性给予T3纠正，T3与核受体（T3R）相结合，然后通过T3应答元件（TRE）与靶基因相结合共同作为转录因子启动基因的表达。对成年甲状腺功能减退大鼠Ng mRNA表达水平进行的研究发现，Ng的表达也发生可逆性的降低：大鼠大脑皮层Ng mRNA水平降低近30%，而在纹状体中则降低约50%。甲状腺机能减退后Ng的变化不仅体现在mRNA水平上，在皮层、纹状体和海马部位的Ng蛋白均较对照组降低［12］。

据此，本实验选取外源性补充RA和T3作为干预因素，观察二者能否上调SD后Ng的表达量，以及能否有效缓解或对抗SD对大鼠的神经行为和LTP的影响。实验结果表明腹腔注射RA和T3可以有效地上调SD后海马中下降的Ng蛋白量，使大鼠自发行为和探究活动增加，缓解神经系统的抑制状态，并且明显消除或减轻SD对海马神经突触可塑性和神经元兴奋性的损伤作用。研究结果进一步证实Ng在SD损害认知功能中的重要作用并为寻找预防或缓解SD损害认知功能的有效措施提供实验依据。

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