新型斑蝥素羧酸衍生物的合成及其抗癌活性*

李贺敏，彭国平，陈 农，李贺莱

(1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210046;2.中国人民解放军61769部队，山西文水 041000)

斑蝥素对肝癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌及食道癌等具有良好的疗效，其优势在于在抑制肿瘤细胞的同时，不降低周围血液中的白细胞数量，对机体没有明显的免疫抑制作用。这种少有的疗效受到人们的广泛关注［1，2］。

斑蝥素具有强烈的毒性，对其结构进行修饰改造可以降低其毒性。为此，研究人员们相继合成了一系列去甲斑蝥素衍生物。研究表明，他们具有疗效显着、毒性低的特点。但当剂量增大时，仍有一定的脏器毒性，影响了抗癌效果［3～8］。因此，开发更新的高效低毒衍生物和研制增效减毒新剂型具有重要意义。

本文以DMSO为溶剂，5-氟脲嘧啶(5-Fu)为修饰物，对去甲斑蝥素(2)酸酐环部分进行结构修饰，合成了一个新型的去甲斑蝥素羧酸衍生物(3，Scheme 1)，收率 78.5%，其结构经1H NMR和IR表征。采用L9(33)正交试验考察了原料比，反应温度，反应时间及溶剂用量对反应的影响。结果表明，在最佳反应条件［2 0.5 mmol，n(2)∶n(5-Fu)=1.2，于 140 ℃ 反应 6 h，DMSO用量15 mL］下制备的3收率为78.2%。采用MTT法研究了体外3对人肝癌细胞HepG2的抑制活性。结果表明，3在用药量为250 μmol·L-1时对HepG2的抑制率为89.5%，其IC50为232.4 μmol·L-1，强于 2 的抑制活性。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AC-500型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标);Nicolet 360型傅立叶变换红外光谱仪(KBr压片，于105 ℃干燥［9］)。

顺丁烯二酸酐，化学纯，国药集团化学试剂有限公司;呋喃和5-Fu，化学纯，阿拉丁化学试剂公司;其余所用试剂均为化学纯，其中丙酮经氯化钙干燥24 h后使用。

1.2 合成

(1)7-氧杂双环［2.2.1］庚-5-烯-2，3-二甲酸酐(1)的合成

在圆底烧瓶中依次加入THF 100 mL和顺丁烯二酸酐7.5 g(0.77 mol)，搅拌下于室温加入呋喃11 mL(0.15 mol)，搅拌使其溶解后反应24 h。抽滤，滤饼用无水乙醚洗涤，用乙酸乙酯重结晶得白色固体1 10.76 g，收率 92%，m.p.112.0 ℃ ～113.2 ℃;1H NMR δ:6.59(t，2H，5，6-H)，5.47(t，2H，1，4-H)，3.31(d，J=0.9 Hz，2H，2，3-H);IR ν:1 813，1 758(C=O)，1 655(C=C)，1 247(C-O-C)cm-1。

(2)7-氧杂双环［2.2.1］-2，3-二甲酸酐(去甲斑蝥素，2)的合成

在反应瓶中加入1 10 g(60 mmol)和丙酮90 mL，搅拌使其溶解;加入5%Pd/C 1.5 g，抽真空，通氢气氢化反应48 h。抽滤，滤液减压蒸除溶剂得白色固体 2 9.3 g，收率 92.3%，m.p.113.3℃ ～115.2 ℃;1H NMR δ:3.39(m，2H，1，4-H)，3.00(m，2H，2，3-H)，1.62(m，4H，5，6-H);IR ν:1 801，1 746(C=O)，1 179(C -O -C)cm-1。

(3)3的合成

在反应瓶中依次加入2 84.1 mg(0.5 mmol)，5-Fu 78.1 mg(0.6 mmol)及 DMSO 15 mL，搅拌下于140℃(浴温)反应6 h。蒸除过量DMSO，残余物依次用甲醇、乙酸乙酯和正己烷重结晶得白色粉末 3 121.7 mg，收率 78.5%，m.p.193.5 ℃ ～195.2 ℃;1H NMR δ:11.5(s，1H，CO2H)，8.3(s，1H，NH)，7.8(s，1H，NCH)，4.8(m，2H，1，4-H)，3.7(m，2H，2，3-H)，1.8(m，4H，5，6-H);IR ν:3 500 ～ 3 100(NH)，1 713(C=O)cm-1。

1.3 体外抗癌活性测定

以5-Fu为对照药剂，采用噻唑兰(MTT)［10］比色法测定3对人肝癌细胞HepG2的抑制率。取对数生长期细胞以0.25%胰蛋白酶消化后，用培养液稀释吹打成单细胞悬液。将细胞悬液(c2×105mol·mL-1)接种于 96孔板中，每孔 90 μL，培养24 h细胞贴壁后，试验组分别加入10 μL的供试药，空白对照组加入等体积的无血清培养液，阳性对照组分别加入c为20 μg·mL-1或30 μg·mL-1的5-Fu的 DMSO溶液，每组设5个复孔。加入试药培养24 h和48 h，每个反应孔再加入新鲜配制20 μL的含5 mg·mL-1MTT的 PBS溶液，于37℃培养箱中继续培养4 h。除去上清液，加入100 μL DMSO溶剂，振荡，待结晶充分溶解混匀后，用酶标仪于490 nm处测定各孔的OD值，将每组的OD值代入下式，计算抑制率［11］。

2 结果与讨论

2.1 合成3的反应条件优化

由于至今未见2与5-Fu反应的相关文献，本文参考文献［1］方法合成3。采用L9(34)正交试验考察诸因素对反应的影响，寻找最佳反应条件，获得最佳的合成3的方法。

2与5-Fu发生酰化反应时，2中不含有碳碳双键，不会自聚，所以反应中不用加阻聚剂［12］。2和5-Fu的反应是酸酐的氨解反应，是一个动态反应体系，产物的收率受原料比［n(2)∶n(5-Fu)］(A)，反应温度(B)，反应时间(C)及溶剂DMSO用量(D)的影响(表1)。

表1 合成3的正交试验设计与结果*Table 1 Design and results of orthogonal experiment for synthesizing 3

由表1可见，A对收率影响最大。5-Fu过量有利于提高3的收率;当A=1.2时，收率最高。从表1还可见，各因素对收率的影响顺序为:A＞B＞C＞D，最佳条件为A2B2C3D1。由于溶剂用量对收率影响不大，单独考察DMSO用量对反应的影响，实验结果表明，DMSO用量为15 mL时收率最高。最佳反应条件实为A2B2C3D3，即n(2)∶n(5-Fu)=1.2，于140℃反应6 h，DMSO 用量15 mL。用最佳反应条件(A2B2C3D3)做三次平行实验，收率分别为78.2%，77.9%，78.5%，平均为78.2%，重现性较好。

2.2 抗癌活性

1～3的抗癌活性见表2。由表2可见，细胞在加入供试化合物24 h后，1～3对体外肝癌细胞的生长均有较强的抑制作用。1在用药量为250 μmol·L-1时抑制率最高［(73.5 ±0.91)%，IC50268.2 μmol·L-1］，2 在用药量为 500 μmol·L-1时抑制率最高［(67.6 ±2.7)%，IC50281.9 μmol·L-1］，3 在用药量为 500 μmol·L-1时抑制率最高［(78.4 ± 0.81)%，IC50190.1 μmol·L-1］。48 h后，1～3对肝癌细胞生长的抑制作用同样明显:1在用药量为250 μmol·L-1时抑制率最高［(68.8 ±0.76)%，IC50322.4 μmol·L-1］，2 在用药量为 500 μmol·L-1时抑制率最高［(81.1 ±2.77)%，IC50332.5 μmol·L-1］，3 在用药量为 250 μmol·L-1时抑制率最高［(89.5 ±0.72)%，IC50232.4 μmol·L-1］。由此可见，3对人肝癌细胞HepG2有较好的抑制作用。

3 结论

本文引入5-Fu对去甲斑蝥素的酸酐环进行结构修饰，合成了含有羧基的去甲斑蝥素衍生物，以期能研制增效减毒型的抗癌新药。

去甲斑蝥素结构中的活性基团并不多，氧桥是斑蝥素类化合物抗癌的主要活性官能团。含有氧桥结构的化合物均对肿瘤细胞有着一定的抑制作用，但双键的存在与否对化合物的抗肿瘤活性并没有太大的影响(因1和2对HepG2的抑制活性并没有明显的差异)，但酸酐环开环后得到的羧酸衍生物3较1和2对HepG2的抑制活性增强，可能是由于羧基作为亲水性基团，与酸酐环的稳定五元环结构相比，生物利用度更高，更易于与机体细胞结合，有较好的抗肿瘤活性。

表2 化合物对人肝癌细胞HepG2生长的抑制率Table 2 Inhibition rates of compounds to human liver cancer cell HepG2

［1］Mc Cluskey A，Bowyer M C，Collins E，et al.Anhydridemodifie cantharidin analogues:Synthesis，inhibition of protein phosphatases 1 and 2A and anticanceractivity［J］.Bioorg Med Chem Lett，2000，10:1687 -1690.

［2］安巍巍，王敏伟，龚显峰，等.去甲斑蝥素通过半胱氨酸天冬氨酸酶诱导HeLa细胞凋亡［J］.中国病理生理杂志，2005，21(3):417 -421.

［3］李泳秀，孙晓飞，魏初铨.氮取代去甲斑蝥酰亚胺衍生物的合成及抗惊厥活性研究［J］.中南药学，2008，6(5):549 -552.

［4］范锋，孙晓飞.去甲斑蝥素-半乳糖衍生物的合成与抗癌活性［J］.药学学报，2008，48(2):157 -161.

［5］董环文，刘超美，李科.新型去甲斑蝥素衍生物的设计合成及体外抗肿瘤活性［J］.第二军医大学学报，2008，29(12):1470 -1474.

［6］ZHOU Yue，CAI Yu-chen，ZHANG Xue-jing，et al.Design and synthesis of disodium phosphate derivatives of norcanthar idin［J］.Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2006，15(1):28 -32.

［7］洪维为，张雅昕，吕娉婷，等.去甲斑蝥素壳聚糖的合成与抗肿瘤活性考察［J］.中国药剂学杂志，2009，7(3):171 -176.

［8］李太华.两种去甲基斑蝥素衍生物的合成，125I标记及其动物体内分布［J］.同位素，1998，11(2):95-99.

［9］Xu J，Butler I S.High-pressure infrared and FT-raman investigation of a dental composite［J］.Biomaterials，1997，18(24):1653 -1657.

［10］洪维为，张雅昕，吕娉婷，等.去甲斑蝥素壳聚糖的合成与抗肿瘤活性考察［J］.中国药剂学杂志，2007，7(3):171 -173.

［11］姚燕丹，林少芒.去甲斑鳌素的研究进展及其与乳腺癌的关系［J］.中国医药导刊，2005，7(1):58-60.

［12］兰云军，李临生，杨锦宗.马来酸酐与乙醇胺的酰化反应研究［J］.中国皮革，1999，28(15):7 -10.