β-淀粉样多肽自聚集抑制剂的电化学筛选方法研究

张琳，林亲录*，阳明辉

（1.中南林业科技大学稻谷及副产物深加工国家工程实验室，湖南长沙410004）

（2.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙410004）

（3.中南大学化学化工学院，湖南长沙410083）

0 引言

β-淀粉样多肽（Amyloid-β,Aβ）是阿尔茨海默（Alzheimer’s disease,AD）病人脑中老年斑的主要成分[1～2]。Aβ由39～43个氨基酸残基组成[3]。由于Aβ是两亲性多肽，所以在一定的条件下Aβ可发生自聚集。其过程为：Aβ由无规则的α螺旋结构转化为具有β折叠结构的寡聚体（oligomer）；接着，这些寡聚体和单体又相互聚集，快速形成纤维前体（protofibril）；然后，Aβ单体和寡聚体在已经生成的纤维前体表面和两端继续聚集，形成光滑、成熟的纤维（fibril）[4]。这些不同阶段的聚集物都具有一定的神经细胞毒性，会引起一系列的发病级联，从而造成神经元的损伤、甚至死亡，导致AD病发[5]。因此抑制Aβ自聚集，从而抑制Aβ毒性聚集物的出现，是治疗AD病的重要途径[6～7]。

能够抑制Aβ自聚集的化合物被称为Aβ自聚集抑制剂[8～11]。目前Aβ自聚集的抑制剂分为两类：一类是基于Aβ自聚集的多肽片段（KLVFF）的多肽型抑制剂[12]；另一类是从计算机分子数据库中筛选出来的，或者是由动植物中提取出来的小分子化合物[13～15]。在数以千万计的多肽和小分子化合物中，能够快速、简便的筛选出对Aβ自聚集有抑制效果的抑制剂，对于AD病的治疗有着重要的指导意义。

1 Aβ自聚集抑制剂的筛选存在的挑战

由于Aβ自聚集的速度快，因此利用常规的检测手段无法确定抑制剂的作用对象（单体、寡聚体、纤维前体或纤维）[16]；另外，要确定化合物是否对Aβ自聚集有抑制效果，需要进行长时间的观测（一般为24～48 h），并且需要昂贵的检测仪器[17～18]。因此面对数以千万计的化合物，对筛选Aβ自聚集抑制剂的方法的要求是，快速、简便、灵敏、廉价。

2 筛选Aβ自聚集抑制剂的常规方法

目前，筛选Aβ自聚集抑制剂的方法主要分为两大类：一类是检测化合物是否能与Aβ结合。常用筛选方法有：利用计算机模拟技术（例如分子动力学模拟技术，molecular dynamics simulations,MD）计算化合物与Aβ的结合位点[19～20]；利用表面等离子体激光共振（surface plasmon resonance,SPR）技术检测化合物与Aβ的结合常数[21]等[22]。但此类方法一般要结合其他检测手段，才能确定能够与Aβ结合的化合物是否能抑制Aβ自聚集。另外一类，是动态的实时检测化合物与Aβ混合溶液的理化性质，与相应的Aβ溶液相比较，从而确定该化合物是否对Aβ自聚集有抑制效果。常用的筛选方法有利用荧光指示剂（比如硫黄素t,ThT）检测纤维形成的荧光法[23]、利用成像技术（电镜、原子力显微镜等）检测Aβ聚集物形貌的成像法[24～25]和电化学检测法[26]等。

2.1 计算机模拟技术筛选Aβ自聚集抑制剂

通过计算机模拟技术可得到化合物与Aβ结合位点以及结合的能量信息[13,27]。通过这些信息，可预测该化合物是否可与Aβ结合，但尚需要通过其他实验手段（比如荧光指示剂ThT检测纤维的生成、AFM检测不溶性聚集物的生成等）来验证化合物是否能够抑制Aβ的自聚集过程[28]。因此，计算机模拟技术只能对化合物起到初步筛选的作用[28]。目前此种方法大部分用于Aβ自聚集抑制剂的初步筛选和Aβ抑制剂抑制Aβ自聚集的机理研究方面。

2.2 SPR技术筛选Aβ自聚集抑制剂

SPR技术可以得到化合物与Aβ的结合常数，根据结合常数，可以判断该化合物与Aβ的结合强度[29]。但化合物可以与Aβ结合并不意味着可抑制Aβ自聚集。所以，与计算机模拟技术类似，还需要利用其它检测手段来确定该化合物是否是Aβ自聚集的抑制剂。例如，用空间排阻色谱（size exclusion chromatography,SEC）来检测化合物与Aβ结合后，水溶性聚集物（水溶性寡聚体）的产生是否受到抑制；利用原子力显微镜或者扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM），检测不溶性聚集物（不溶性寡聚体、纤维前体和纤维）的产生是否受到抑制[21]。但SPR的检测芯片为金膜，在金膜上组装Aβ或者Aβ自聚集的多肽片段，步骤繁琐。此外，多肽在金膜表面有非特异性吸附，为了避免非特异吸附引起的SPR信号的变化对结果造成干扰，芯片需要进行封闭。因此利用该方法不仅筛选速度慢，并且过程繁琐、需要的试剂和仪器都比较昂贵。为了提高筛选效率，基于SPR技术的高通量的微阵列技术（microarray）被引入到Aβ自聚集抑制剂的研究中来[30]。但与单通道或者双通道的SPR技术类似，微阵列技术只能检测到化合物是否能与Aβ结合，并不能确定该化合物是否能抑制Aβ自聚集的过程。

2.3 ThT荧光技术筛选Aβ自聚集抑制剂

ThT可以插入到Aβ纤维的β折叠中，从而特异性的与Aβ纤维前体和纤维结合。同时，插入β折叠中的ThT的荧光信号会大大增强[31]。基于这一原理，ThT被用来动态监测Aβ溶液中纤维的形成，并用于Aβ自聚集抑制剂的筛选[32]。该方法的缺陷是只能检测到Aβ自聚集后期，纤维前体或者纤维的生成，而在Aβ聚集前期，Aβ单体和可溶性的Aβ寡聚体无法用ThT检测到。研究发现，可溶性的Aβ寡聚体具有比纤维更高的神经细胞毒性[33]。因此利用ThT荧光法来筛选Aβ自聚集抑制剂，只能筛选到可抑制Aβ纤维生成的抑制剂，并不能得到可抑制Aβ可溶性寡聚体生成的抑制剂。

2.4 成像技术筛选Aβ自聚集抑制剂

成像技术（电镜、原子力显微镜等）可以实时检测溶液中不溶性、纳米级的聚集物的形态[34]。通过对聚集物形态的检测，可确定抑制剂是否可以抑制Aβ自聚集。与ThT荧光技术类似，该技术无法检测到Aβ自聚集前期，可溶性的Aβ寡聚体或者Aβ单体。Aβ单体不具神经细胞毒性，可溶性寡聚体具有较强的神经细胞毒性[33]。因此无法分辨Aβ单体和寡聚体，就无法分辨该抑制剂是否有抑制Aβ神经细胞毒性的作用。

2.5 电化学技术筛选Aβ自聚集抑制剂

电化学方法简单、灵敏，可实时检测化合物对Aβ自聚集的抑制过程，故电化学方法在筛选Aβ自聚集抑制剂方面具有广泛的应用[35～36]。电化学方法筛选Aβ自聚集抑制剂，是从利用电化学方法检测Aβ自聚集的过程中发展起来的[37]。Vestergaard等[38]在2005年首先利用玻碳电极，通过检测Aβ十位上酪氨酸（tyrosine,Tyr）的电化学信号，实时检测了Aβ(1-42)和Aβ(1-40)的自聚集过程（图1）。该工作发现，随着Aβ(1-42)/Aβ(1-40)自聚集的进行，Tyr的电化学信号会随之降低。导致Tyr电化学信号降低的原因有两方面：一方面，Aβ(1-42)/Aβ(1-40)自聚集生成沉淀，导致可溶性Aβ浓度的降低；另一方面，由于Aβ(1-42)/Aβ(1-40)自聚集过程中二级结构的变化，导致Tyr上电子转移到电极表面的速率降低。因此通过对Tyr电化学信号的实时检测可以得到Aβ自聚集的动态信息。由于Tyr的电化学信号较弱，并且在Aβ自聚集的过程中不稳定，因此直接利用该方法筛选Aβ自聚集抑制剂有一定的困难，且容易出现异常结果，导致结论出现偏差[39]。

图1 方波伏安法实时检测Aβ(1-42)（红色曲线）和Aβ(1-40)（蓝色曲线）的自聚集过程Fig.1 Kinetic study of Aβ(1-42)(red line)and Aβ(1-40)(blue line)aggregation,using SWV.Inset:Voltammograms of native Aβ(1-42)(red line)and Aβ(1-40)(blue line)

针对该问题，Fuente等[40]利用碳纳米管修饰玻碳电极，使修饰后的电极具有更好的导电性，从而提高了检测Tyr电化学信号的灵敏度和稳定性，并实时检测了多肽型抑制剂（LPFFD）对Aβ自聚集的抑制过程（图2）。该研究发现，Aβ自聚集时，产生的聚集物会导致溶液中Tyr电化学信号的降低。而LPFFD可有效抑制Aβ聚集物的形成、降解已经形成的Aβ聚集物，使溶液中Tyr的电化学信号升高。基于此种原理，该方法可以用于筛选Aβ自聚集的多肽型抑制剂。

图2 LPFFD降解Aβ聚集物的电化学检测图（插图：电镜检测）Fig.2 Disaggregation of Aβ(1-42)by LPFFD.Aβ(1-42)was allowed to aggregate at 28℃until the electrochemical signal was undetectable.Afterwards,the solution was incubated in the presence(■)or absence(◇)of LPFFD at roomtemperature

全长的Aβ(1-42)/Aβ(1-40)价格昂贵，利用其进行Aβ自聚集抑制剂的筛选成本较高，不适合大规模的筛选。另外，Tyr处于Aβ(1-42)的第十位，在Aβ聚集物的外侧，并不包裹在Aβ聚集物中[41]，因此直接检测Tyr的电化学信号并不能真实的反应抑制剂对Aβ自聚集过程的抑制作用。为了避免这个问题，Kraatz课题组在金电极上组装Aβ自聚集片段（Aβ(12-28)），利用电化学阻抗法进行Aβ自聚集抑制剂的筛选[42]（图3）。该研究发现，当Aβ自聚集抑制剂与Aβ紧密结合时，金电极表面被抑制剂和Aβ的络合物紧密包裹，溶液中铁氰化钾离子较难扩散到达电极表面，从而引起电极阻抗值增大；与之相反，Aβ纤维的荧光指示剂（刚果红）可以插入Aβ分子之间，使Aβ分子间的空隙增大、溶液中离子容易渗透到电极表面，从而导致检测到的电极阻抗值降低。基于这种原理，通过检测电极阻抗值的大小就可以快速、简便的筛选出Aβ自聚集抑制剂。该种方法缩短了Aβ的序列，使筛选Aβ自聚集抑制剂的成本得到了降低。但是要将Aβ片段组装在金电极表面，需要对Aβ片段进行修饰，并且步骤冗杂。

图3 金电极上修饰的Aβ(12-28)与β-折叠阻断肽（BSB）结合后的电极阻抗值（蓝色曲线），与刚果红（CR）结合后的电极阻抗值（红色曲线）Fig.3 Faradic impedance spectra of Aβ(12-28)peptide film interaction with β-sheet breaker(BSB)peptide(blue line)or Congo red(CR)(red line)

上述的筛选Aβ自聚集抑制剂的方法非常适合于筛选多肽型抑制剂，但是当抑制剂自身也具有电化学信号时，上述的方法无法将溶液中被测的具有氧化还原活性的物质（Tyr和铁氰化钾）和抑制剂区分开，从而使抑制剂的电化学信号影响检测结果。

近来，Zhang等[43]利用二茂铁（ferrocene,Fc）标记的Aβ自聚集片段（Fc-KLVFFAE）模拟全长Aβ自聚集的过程。Fc的引入，大大提高了Aβ自聚集片段的电化学信号，使电化学检测更容易进行。同时，该工作利用高效液相色谱与电化学联用技术（HPLC-EC）检测了小分子抑制剂——姜黄素对Aβ（Fc-KLVFFAE）自聚集过程的抑制作用。由于姜黄素含有酚羟基，具有电化学活性，因此利用常规的、直接的电化学方法并不能检测到其抑制Fc-KLVFFAE自聚集的过程。因此HPLC的引入，可将Fc-KLVFFAE与姜黄素有效的分离，再利用恒电位法检测溶液中可溶性的Fc-KLVFFAE的电化学信号，就可实时检测姜黄素抑制Fc-KLVFFAE自聚集的过程（图4）[43]。该方法可用于筛选具有电化学活性的Aβ自聚集抑制剂。

图4 电化学方法检测不同时间内Fc-KLVFFAE溶液（a）和Fc-KLVFFAE/姜黄素混合溶液中（b）可溶性Fc-KLVFFAE的浓度Fig.4 Variations of Fc-KLVFFAE concentrations in solutions of Fc-KLVFFAE(curve a)and a Fc-KLVFFAE/curcumin mixture(curve b)over different incubation times

3 结语

近年来，随着AD患者的增多，AD病的治疗药物逐渐受到人们的关注。作为潜在的治疗AD病的药物——Aβ自聚集抑制剂，其研究也受到AD研究领域的重视。由于小分子化合物和多肽抑制剂数量众多，快速、简便的筛选Aβ自聚集抑制剂的方法也不断涌现出来。目前应用较多的筛选方法是计算机模拟技术、SPR技术、荧光技术、成像技术及电化学技术。电化学方法简单、灵敏、快速，在对Aβ自聚集抑制剂的筛选中扮演着重要的角色。虽然筛选Aβ自聚集抑制剂的方法有了很大的发展，但是筛选出的抑制剂能否作为治疗AD病的药物，运用于临床还需要进一步的研究和探索。

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