巨核细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶2的克隆表达及其与骨质疏松症的关系

张 蕾，张师桃，曾晛阳，张小平，郝凡凡，王 丰，李婉南，付学奇

（1.吉林大学生命科学学院Fischer细胞信号转导实验室，吉林 长春 130012；2.吉林大学中日联谊医院妇产科，吉林 长春 130033）

蛋白质酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTPs）与蛋白质酪氨酸激酶（protein tyrosine kinases，PTKs）协同作用控制着蛋白质酪氨酸的磷酸化过程，调节细胞生长发育，并在细胞信号传导过程中发挥重要作用［1－2］，许多生理及病理现象均与二者的异常表达相关［3］。巨核细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶2（megakaryocyte protein tyrosine phosphatase 2，PTPMEG2）也称为PTPN9，是一种在细胞内广泛分布的酶，最初从人的巨核细胞MEG－01和脐静脉内皮细胞cDNA文库中克隆获得［4］。PTPMEG2与其他的细胞质PTP有所不同，PTPMEG2的表达使其在分泌小泡中积累。研究［5］表明：分泌小泡的融合和增殖均依赖于PTPMEG2的活性调节，说明PTPMEG2在分泌小泡的生物发生过程中发挥重要作用。虽然PTPMEG2在细胞中广泛分布，但到目前为止对PTPMEG2功能的研究还很少。

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是以低骨量及骨组织微结构退变为特征的一种全身性代谢性骨疾病，伴有骨脆性增加和骨强度降低，易发生骨折等现象。目前已有研究［6］表明：PTPs的活性对破骨细胞的形成和功能有重要作用。PTPs是参与骨代谢中破骨细胞和成骨细胞活动的一个重要因素，低相对分子质量的PTPs对成骨细胞活动发挥重要作用［7］。但是目前尚未见有关PTPMEG2与骨质疏松症关系方面的研究报道。PTPMEG2主要调控某些免疫细胞及造血细胞的功能，而这些细胞在骨髓内的功能发挥均依赖于骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs），这正是骨组织的来源及骨质疏松症的发病根源。因此本文作者推测PTPMEG2与骨质疏松症间可能存在着一定的联系。本研究探讨PTPMEG2的表达及其与骨质疏松症的关系，旨在为骨质疏松症的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 新西兰大白兔购于吉林大学基础医学院动物中心，动物合格证号：SCXK－（吉）2008－0005。雌性SD大鼠购于吉林省中医研究所动物实验中心，动物合格证号：SCXK－（吉）2007－0003。对硝基苯磷酸二钠（pNPP）、Tryptone、Yeast Extract、Q－Sepharose Fast Flow和SP－Sephadex购于Sigma公司。二硫苏糖醇（DTT）、（不）完全弗氏佐剂、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒和酸性磷酸酶（ACP）试剂盒购于鼎国生物技术公司。

1.2 PTPMEG2催化结构域的分离纯化 编码PTPMEG2蛋白催化结构域重组体质粒由美国俄克拉荷马大学赵志壮博士惠赠，将其连接到含有EcoRⅠ酶切位点的表达载体pT7上，重组体pT7－PTPMEG2质粒转化到大肠杆菌DE3细胞中进行高效表达，并于LB＋Amp培养基中扩大培养。PTPMEG2重组蛋白的可溶性部分通过Q－Sepharose Fast Flow和SP－Sephadex 2种离子交换柱层析进行分离纯化。其主要过程为PTPMEG2蛋白的菌液上清Q－Sepharose Fast Flow离子交换柱后，用不同浓度的NaCl Buffer Q溶液洗脱，同时以pNPP作为底物活性跟踪收集洗脱液。收集这部分洗脱液上SP－Sephadex离子交换柱，用不同浓度的NaCl Buffer S溶液洗脱，以pNPP作为底物活性跟踪收集蛋白洗脱液。测定蛋白纯度及酶的比活力。

1.3 多克隆抗体制备 将纯化后的PTPMEG2催化结构域冻干粉用0.2mol·L－1、pH 7.0的PBS溶解，蛋白浓度调节为1g·L－1，与等体积的完全弗氏佐剂混合、乳化，乳化时间约为30min，通过家兔背部皮下多点注射法进行免疫，在基础免疫的2周后，每隔7d进行1次加强免疫，共进行3次，最后一次免疫7d后采集血清样本。采血前家兔需禁食12h，但不禁水。将抗体血清分别按体积比稀释，于PVDF膜上点样，采用ECL显色实验检测抗体效价。抗原蛋白浓度调节到10g·L－1，10倍梯度稀释，于PVDF膜上点样，采用ECL显色实验检测抗原对抗体的灵敏度。

1.4 建立骨质疏松症动物模型 30只雌性SD大鼠，体质量约为200g，随机分为模型组（n＝15）和对照组（n＝15），记录体质量。对照组大鼠采用生理盐水灌胃，灌胃量为10mL·kg－1·d－1；模型组大鼠采用7g·L－1维甲酸溶液灌胃，灌胃量为10mL·kg－1·d－1，持续给药3周，其间每天记录大鼠的形态并称量体质量。如果大鼠骨脆性增加，ACP和ALP表达水平超出正常范围，说明建模成功。

1.5 检测大鼠血清中ACP和ALP水平 对照组及模型组大鼠建模前后均进行12h断食，然后采集血清，用试剂盒检测大鼠血清中ACP和ALP表达水平，比较2组大鼠在建模前后血清中ACP和ALP表达水平的变化。

1.6 骨组织提取、培养BMSCs 处死大鼠，将其浸入75%酒精中消毒10min，在无菌条件下分别取大鼠的股骨及胫骨，去除周围肌肉及软组织，于75%酒精中保存，比较2组大鼠腿骨形态上的差异并记录。提取大鼠其他组织（肝、脾、肾、肺、大脑、肌肉及卵巢），PBS清洗外周残余血，加入适量Buffer A溶液研磨，于4℃、15000r·min－1离心15min，取上清备用，沉淀部分于－70℃冻存。取大鼠股骨置于平皿中，DMEM培养基对其进行冲洗，用灭菌的剪刀剪去股骨两端，再向股骨中注射培养基，使BMSCs被冲至另一平皿中，收集细胞液。1000r·min－1离心5min，加入3mL 0.83%的氯化铵溶液，用于红细胞裂解。振荡10min，1000r·min－1离心5min，PBS清洗2次，1000r·min－1离心5min，取上清备用。沉淀部分加入10mL DMEM，转移中至培养皿中，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。每天记录细胞形态，定期更换培养基，21d后，取细胞用胰酶进行消化，并用Buffer A处理后备用。

1.7 检测PTPMEG2的表达水平 取大鼠上述组织用Buffer A提取组织细胞，将蛋白浓度调至2g·L－1，进行SDS－PAGE电泳，转膜后进行Western blotting检测。比较2组大鼠各组织中PTPMEG2表达水平的差异。

1.8 检测骨髓细胞（BMCs）、骨髓红细胞及BMSCs中PTPMEG2的表达水平 将提取的BMSCs的蛋白浓度调整为1g·L－1，经SDS－PAGE电泳，转膜后进行Western blotting检测。比较2组大鼠BMCs、骨髓红细胞及BMSCs中PTPMEG2表达水平的差异。

1.9 统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。大鼠血清中ACP和ALP表达水平以表示，组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1 PTPMEG2催化结构域蛋白的分离纯化 经Q－Sepharose Fast Flow离子交换柱后，活性跟踪发现目的蛋白主要存在于0.05～0.10mol·L－1NaCl Buffer Q的洗脱液中。收集这部分洗脱液上SP－Sephadex离子交换柱，活性跟踪发现目的蛋白主要存在于0.2mol·L－1NaCl Buffer S的洗脱液中。将各纯化步骤的收集液进行SDS－PAGE电泳检测，凝胶成像分析显示：在0.2mol·L－1NaCl Buffer S的洗脱液中目的蛋白的纯度为94.8%。见图1。

图1 PTPMEG2催化结构域蛋白的纯化Fig.1 Purification of PTPMEG2

2.2 PTPMEG2多克隆抗体效价及抗原对抗体的灵敏度 PTPMEG2免疫前效价很低，仅在稀释比为1∶1时可见特异性结合（图2A）。经PTPMEG2免疫后，效价明显升高，抗体效价可达到1∶10000（图2B）。当PTPMEG2抗原量为10ng时，仍可与抗体特异性结合（图2C）。

2.3 骨质疏松症模型大鼠大体观察 模型组大鼠维甲酸灌胃给药后表现出行动迟缓、食欲下降、脱毛等现象，体质量增长幅度也表现出下降的趋势；对照组大鼠平均体质量增加47.44g，模型组大鼠平均体质量增加21.12g（2只死亡）。见图3（封二）。

2.4 大鼠血清中ACP和ALP表达水平 模型组大鼠血清中ACP及ALP表达水平在建模后均明显升高（P＜0.01），而对照组无明显变化。建模后模型组大鼠血清ACP和ALP表达水平均高于对照组（P＜0.01）。见表1。

2.5 2组大鼠股骨和胫骨形态及脆度 在相同条件下，建模后大鼠的股骨和胫骨破碎数量较多，与其ACP和ALP表达水平的显著升高相对应。见图4（封二）。

2.6 大鼠BMSCs的形态学改变 取建模前后大鼠股骨及胫骨的骨髓，培养BMCs，培养3d左右，开始有贴壁的纺锤形细胞出现（图5，见封二），继续培养21d后，可出现大量贴壁的BMSCs。

图2 免血清PTPMEG2免疫前（A）、免疫后（B）效价和PTPMEG2蛋白灵敏度（C）Fig.2 Titers of rabbit serum PTPMEG2before immunization（A）and after immunization（B）and sensitivity of PTPMEG2 protein（C）

表1 2组大鼠血清ACP和ALP表达水平比较Tab.1 Comparison of rat serum ACP and ALP expression levels between two groups［n＝5，，λB／（U·L－1）］

表1 2组大鼠血清ACP和ALP表达水平比较Tab.1 Comparison of rat serum ACP and ALP expression levels between two groups［n＝5，，λB／（U·L－1）］

＊P＜0.01compared with control group；△P＜0.01compared with before modelling.

Group ACP Before modelling After modelling ALP Before modelling After modelling Control 175.1±1.5178.6±1.6162.3±1.1132.5±1.0＊△Model 179.3±1.4247.6±1.7＊△171.9±1.3295.6±1.4＊△

2.7 PTPMEG2在大鼠各组织中的表达水平 将提取到的大鼠各组织进行SDS－PAGE电泳，并进行Western blotting法检测，PTPMEG2在大鼠的各种组织中均有表达，其中模型组大鼠肾脏组织中PTPMEG2的表达水平明显高于对照组，而其在肌肉组织中的表达水平明显低于对照组。见图6。

图6 PTPMEG2在大鼠不同组织中表达的电泳图Fig.6 Electrophoregram of PTPMEG2 expressions in various tissues of rats

2.8 PTPMEG2在BMCs、骨髓红细胞和BMSCs中的表达水平 与对照组比较，模型组大鼠BMCs中PTPMEG2表达量明显增加，而在BMSCs中其表达量无明显改变（图7）。模型组大鼠骨髓红细胞中PTPMEG2表达量与对照组比较亦无明显改变。见图8。

图7 PTPMEG2在大鼠BMCs和BMSCs中表达的电泳图Fig.7 Electrophoregram of PTPMEG2 expressions in BMCs and BMSCs of rats

图8 PTPMEG2在大鼠骨髓红血胞中表达的电泳图Fig.8 Electrophoregram of PTPMEG2 expression in bone marrow red cells of rats

3 讨 论

本研究中经2种离子交换柱层析后，获得纯度为94.8%、比活力为54606U·mg－1的PTPMEG2蛋白纯品，并制备了效价为1∶10000的多克隆抗体。

本研究参考Hassan等［8］关于骨质疏松症动物模型建立的标准，成功建立了大鼠骨质疏松症动物模型。因ACP和ALP水平是骨质疏松症表征的一个重要指标［9］，本研究结果显示：骨质疏松症模型组大鼠血清ALP及ACP表达水平和骨脆性均高于对照组，骨质疏松症成骨细胞可向成纤维细胞样细胞形态转化，骨钙素、ALP和Ⅰ型胶原的分泌功能部分丧失，使ALP水平降低［10］。本研究中模型组大鼠肾脏组织中PTPMEG2的表达水平明显高于对照组，而其在肌肉组织中的表达水平却低于对照组。可见PTPMEG2有可能与参与肌肉活动的调节并与肾功能相关。BMSCs可以通过体外培养纯化的方法获得，本文作者参考闫冬梅等［11］有关BMSCs的培养方法成功获得大鼠股骨及胫骨的BMSCs，结果表明：与对照组比较，模型组大鼠BMCs中PTPMEG2表达量显著增多，而在骨髓红细胞和BMSCs中其表达量无明显差异。说明PTPMEG2主要表达于成熟的BMCs中，而在红细胞和未分化的BMSCs中则表达较少。Pittenger等［12］研究表明：近30%的骨髓贴壁细胞具有分化为成骨细胞和软骨细胞的特性。说明PTPMEG2主要表达于成熟的BMCs中，而在红细胞和未分化的BMSCs中则表达较少［13］。骨质疏松症大鼠BMCs中PTPMEG2表达量增加，且多发生在骨髓内分化成熟的骨细胞中，说明PTPMEG2可能在骨质疏松症的发展过程中发挥重要的调节作用。

［1］Hunter T.Signaling－2000and beyond［J］.Cell，2000，100（1）：113－127.

［2］李婉南，姜轶群，范晓迪，等.蛋白质酪氨酸磷酸酶及相关疾病［J］.吉林大学学报：医学版，2008，34（6）：1106－1108.

［3］Tonks NK.Protein tyrosine phosphatases：from genes，to function，to disease［J］.Nature Rev Mol Cell Biol，2006，7（11）：833－846.

［4］Wang Y，Vachon E，Zhao ZJ，et al.Tyrosine phosphatase MEG2modulates murine development and platelet and lymphocyte activation through secretory vesicle function［J］.J Exp Med，2005，202（11）：1587－1597.

［5］Cho CY，Koo SH，Wang Y，et al.Identification of the tyrosine phosphatase PTP－MEG2as an antagonist of hepatic insulin signaling［J］.Cell Metab，2006，3（5）：367－378.

［6］Schmidt A，Rutledge SJ，Endo N，et al.Protein－tyrosine phosphatase activity regulates osteoclast formation and function：inhibition by alendronate［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（7）：3068－3073.

［7］Zambuzzi WF，Milani R，Teti A.Expanding the role of Src and protein－tyrosine phosphatases balance in modulating osteoblast metabolism：lessons from mice［J］.Biochimie，2010，92（4）：327－332.

［8］Hassan HA，El Wakf AM，El Gharib NE.Role of phytoestrogenic oils in alleviating osteoporosis associated with ovariectomy in rats［J］.Cytotechnology，2012，Nov 18.［Epub ahead of print］

［9］尚德志，王大章，郑 虎，等.抗骨质疏松药XW630对成骨细胞碱性磷酸酶mRNA表达的影响［J］.中国骨质疏松杂志，2000，8（6）：1－4.

［10］张兴凯，杨庆铭，邓廉夫，等.骨质疏松成骨细胞生物学特征的体外研究［J］.中国骨质疏松杂志，2004，10（1）：48－51.

［11］闫冬梅，徐开林，杜 冰，等.人骨髓基质细胞的培养及鉴定［J］.临床血液学杂志，2009，22（3）：144－146.

［12］Pittenger MF，Machay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stemcells［J］.Science，1999，284（5411）：143－147.

［13］Egermann M，Heil P，Tami A，et al.Influence of defective bone marrow osteogenesis on fracture repair in an experimental model of senileosteoporosis［J］.J Orthop Res，2010，28（6）：798－804.