实时荧光定量PCR检测REST基因在小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义

葛付超,武庆杰,武星汝

(菏泽医学专科学校，山东菏泽274000)

实时荧光定量PCR检测REST基因在小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义

葛付超,武庆杰,武星汝

(菏泽医学专科学校，山东菏泽274000)

目的探讨REST基因在小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义。方法应用实时荧光定量PCR对30例小细胞肺癌组织及癌旁组织中REST进行检测。结果REST在小细胞肺癌组织中的表达水平0.596比正常肺组织0.949明显降低(P＜0.05)，小细胞肺癌组织中REST的表达与肿瘤的分化程度及侵袭性有关（P＜0.05）。结论REST在小细胞肺癌组织中有低表达，可能参与小细胞肺癌的发病，可能有助于小细胞肺癌的早期诊断、治疗及预后。

神经元限制性沉默转录因子；小细胞肺癌；实时定量RT-PCR

肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤，在世界上许多国家和地区，肺癌的发病率占恶性肿瘤的首位。小细胞肺癌约占肺癌的20%，恶性程度高，倍增时间短，转移早而广泛。Sutherland等研究发现成鼠肺癌细胞中的Trp53和Rb1失活，可使神经内分泌细胞转变为小细胞肺癌因此认为神经内分泌细胞是小细胞肺癌的主要起源细胞[1]。小细胞肺癌细胞中可见密集神经分泌颗粒，内含神经内分泌激素，使得小细胞肺癌与内分泌和副肿瘤综合征相关。神经元限制性沉默转录因子（RE1-silencing transcription factor，REST)不仅在神经元的发生和分化过程中起重要的调控作用[2]，而且可能还参与了细胞凋亡、基因复制、转绿调控、血管形成、肿瘤形成等[3-4]。本文应用实时荧光定量PCR对30例小细胞肺癌组织及正常癌旁组织中REST基因进行检测，现将结果报道如下。

1临床资料

1.1一般资料新鲜小细胞肺癌组织和距癌组织30例边缘3 cm以上的正常肺组织，取自2010年1月—12月青海大学附属医院胸外科患者，标本均经病理证实。

1.2主要试剂及仪器TRIzoL试剂、RT-PCR反应试剂盒(美国BD公司)，M-MLV逆转录酶试剂盒(Promega公司产品)，紫外分光光度计(美国Thermo公司)，7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.3 REST基因相对表达量的检测

1.3.1引物和探针的设计与合成所有引物通过primer premier5.0软件设计，由上海英骏生物技术有限公司合成。REST：上游引物：5'-AGTGAAAGGGCACGGAAGG-3'；下游引物：5'-TGGCAGTGGTGGTGATGG-3'。扩增片段长度123bp。GAPDH：上游引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'；下游引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。扩增片段长度225bp。对不同引物序列进行预实验，以保证目的基因与内参基因扩增效率一致且均接近1。

1.3.2总RNA提取及cDNA合成取冻存组织约100mg，采用TRIzoL提取总RNA，紫外分光光度计测定吸光度A260/A280比值，明确RNA纯度及浓度，并经琼脂糖凝胶电泳证实RNA完整。取总RNA2μg经M-MLV逆转录酶试剂盒合成cDNA第一链。反应条件：37℃、65min，72℃、10min。

1.3.3实时荧光定量RT-PCR每一样品均设2个重复孔，反应体系均为10μL，反应条件：94℃变性20 s、95℃5 s、60℃40 s，40个循环。实时荧光定量PCR仪监测记录数据。每次PCR反应后均进行熔解曲线分析以确认扩增产物的特异性。

1.3.4 REST家族基因mRNA表达水平相对定量分析采用2-△△Ct法[5]，计算REST基因表达量，即以GAPDH为内参照基因，计算各样品△Ct(RESTCt-GAPDHCt)，设定△Ct值最大的正常对照为校正样品，计算△△Ct(各样品△Ct-校正品△Ct)，某样品的REST基因mRNA相对表达量(RQ)可用如下公式计算：RQ=2-△△Ct。

1.4统计学处理采用SPSS17.0统计软件，计量资料采用±s表示，REST基因表达水平差异分析采用配对t检验。REST基因与临床病理特征的关系分析采用独立样本t检验。

2结果

2.1 REST基因在小细胞肺癌组织中的表达小细胞肺癌组织中REST基因mRNA水平(0.596±0.143)低于癌旁组织(0.949±0.270)，两者差异具有显著性(P＜0.05),见图1。

2.2 REST基因与临床病理特征的关系小细胞肺癌中RESTmRNA的表达与癌细胞分化程度、淋巴结转移及临床TNM分期有关，而与性别、年龄无关。高/中分化小细胞肺癌高于低分化小细胞肺癌者（0.814±0.266/0.608±0.179）,P＜0.05；有淋巴结转移的小细胞肺癌REST-mRNA表达水平低于无转移者（0.564±0.236/0.828±0.207）,P＜0.05；TNM分期Ⅰ+Ⅱ的小细胞肺癌表达水平明显高于Ⅲ+Ⅳ小细胞肺癌（0.842±0.192/0.568±0.264），P＜0.05。而男、女（0.675±0.232/0.698±0.187）及大于60岁、60岁以下(0.721±0.265/0.671±0.178)REST-mRNA表达均无明显差异（P＞0.05）。

3讨论

小细胞肺癌作为一种侵袭性疾病，疾病进展较快，易发生较早转移，在过去的30年中，小细胞肺癌的研究及治疗几乎没有进展，其发生发展是多基因参与的多步骤、多阶段、多环节、多因素，涉及到细胞内众多分子事件的复杂过程。抑癌基因的缺失和（或）突变及转录调控体系的异常是导致小细胞肺癌发生的主要原因。目前研究表明与小细胞肺癌发生、发展、治疗及预后密切相关的基因包括癌基因p53、RB基因，癌基因Bcl-2、Myc基因及PI3K/AKT/ mTOR信号转导途径[6]。故对小细胞肺癌发生发展中相关基因异常的认识是小细胞肺癌防治的关键。小细胞肺癌具有异质性，其细胞起源目前尚未明确，研究发现，小细胞肺癌起源于支气管黏膜或腺上皮内的Kulchitsky细胞（嗜银细胞），属APUD（amine precursor uptake decarboxylation）瘤[7]。但Park等[8]通过建立鼠小细胞肺癌模型研究发现，小细胞肺癌可能起源于支气管黏膜上皮中可向神经内分泌分化的干细胞。

REST于1995年首次由Mandel实验室发现。REST蛋白含九个锌指结构，作为一个抑制转录因子，REST氨基端的八个锌指结构构成REST的DNA结构域，可以与目标基因调节区域中的抑制元件位点结合而调控基因的转录。REST通常在非神经元细胞核未成熟的神经细胞中表达，它是抑制细胞中神经元相关基因表达的关键因子，其作用是阻止细胞向神经元方向分化[9]。而当神经前体细胞开始向神经细胞分化时，REST蛋白的表达开始逐渐下降，当细胞完全分化为成熟的神经元细胞后，REST几乎无表达[10]。基于REST在抑制细胞向神经元方向分化、抑制神经内分泌相关基因表达方面的重要作用，可以推断在肿瘤细胞内REST功能缺失可能是引起肿瘤出现神经内分泌分化的原因之一，从而进一步影响肿瘤的发生发展。本实验结果显示，在小细胞肺癌组织中，REST的表达明显低于癌旁组织，考虑REST可能通过丧失对干细胞向神经细胞方面分化的抑制作用而参与小细胞肺癌的发生和发展。提示针对REST的靶向治疗，可能为小细胞肺癌的治疗提供新的治疗方向。本研究还显示，REST基因的表达与癌细胞分化程度、淋巴结转移及临床TNM分期有关，提示REST基因的检测可能在小细胞肺癌的临床分期和预后中有一定的临床意义。

[1]Sutherland KD,Proost N,Brouns L,et al.Cell of origin of small cell lung cancer：inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adultmouse lung[J].Cancer cell,2011,19(6)：754-764.

[2]Ooi L,Wood IC.Chromatin crosstalk in developmentand disease：lessons from REST[J].NatRev Genet,2007,8(7)：544-54.

[3]Ariano P,Zamburlin P,D，Alessandro R,etal.Differential repression by the transcription factor REST/NRSF of the various Ca2+signalling mechanisms in pheochromocytoma PC12 cells[J].Cell Calcium, 2010,47(4)：60-368.

[4]Blom T,Tynninen O,PuputtiM,et al.Molecular genetic analysis of the REST/NRSF gene in nervous system tumors[J].Acta Neuropathol, 2006,112(4)：483-490.

[5]庾蕾，刘建平，庄志雄,等.实时RT-PCR基因表达相对定量REST软件分析与2-△△Ct法比较[J].热带医学杂志，2007,7（10）：956-958.

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[7]程颖,柳菁菁.小细胞肺癌转化研究的探索[J].中国新药研究，2012, 21（17）：24-28.

[8]Park KS,Ling MC,Raiser DM,etal.Characterization of the cell of origin for smallcell lung cancer[J].cellcycle,2011,10(16)：2806-2818.

[9]吕辉，文继舫，吴晓英.REST在乳腺癌中的功能研究[C].中华医学会病理学分会2010年学术年会，2010：128-132.

[10]Abrajano JJ,Qureshi IA,Gokhan S,etal.REST and CoRESTmodulate neuronal subtype specification,maturation and maintenance[J]. PlosOne,2009,4(12)：e7936.

Detection and Clinical Significance of REST in Sm all Cell Lung Cancer by Real-tim e Quantitative PCR

Ge Fuchao,W u Qingjie,W u X ingru
（Heze MedicalCollege,Heze 274000,Shandong）

Ob jectiveTo explore the clinicalsignificance of REST expression in small cell lung cancer.M ethodsThe real-time quantitative RT-PCR wasused to detect the expression of RESTmRNA in 30 patientsw ith small cell lung cancer and their normal transitional cell tissues.Resu ltsThe expression of RESTmRNA in the small cell lung cancer tissues(0.596)was significantly down-regulated than that in the normal transitional cell tissues(0.949).The expression RESTmRNA in well-moderated differentiation small cell lung cancerwere higher than those in poor differentiation small cell lung cancer(P＜0.05).ConclusionThere isaberrantexpression of REST in small cell lung cancer.They are involved in the pathogenesisof small cell lung can cer.To detect theexpression of RESTmRNA may be a reliablemeans for early diagnosis,treatmentand prognosisof small cell lung cancer.

RE-silencing transcription factor;Small cell lung cancer;Real-time quantitative PCR

R.3647

：A

：1008-4118（2013）02-0008-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2013.02.03

2013-03-29