PD-L2在人胎盘间充质干细胞上的表达及其生物学意义

张思英,张佳伦

(菏泽医学专科学校,山东菏泽274500)

PD-L2在人胎盘间充质干细胞上的表达及其生物学意义

张思英,张佳伦

(菏泽医学专科学校,山东菏泽274500)

目的探讨PD-L2在人胎盘间充质干细胞黏附和迁移过程中的生物学意义。方法应用消化法分离、培养人胎盘间充质干细胞，体外扩增培养3代后用于实验；RT-PCR检测PD-L2在人胎盘间充质干细胞上的表达；应用化学合成的PD-L2 siRNA阻断PD-L2在人胎盘间充质干细胞上的表达；细胞计数法检测人胎盘间充质干细胞的黏附能力；Transwell法检测人胎盘间充质干细胞的迁移能力。结果人胎盘间充质干细胞高表达PD-L2分子，PD-L2 siRNA能有效阻断人胎盘间充质干细胞对PD-L2的表达；细胞计数结果显示，接种后0.5 h阻断组人胎盘间充质干细胞的黏附率与正常对照组相比无显著升高，在接种后1 h和3 h，阻断组人胎盘间充质干细胞的黏附率均明显高于正常对照组；Transwell检测结果显示，与正常对照组相比，在DMEM-LG、含SDF-1α的DMEM-LG、人胎盘间充质干细胞培养上清三种培养条件下，阻断组细胞迁移率均显著降低。结论PD-L2表达在人胎盘间充质干细胞，且在人胎盘间充质干细胞的黏附和迁移中发挥重要作用。

人胎盘间充质干细胞；PD-L2；黏附；迁移

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有多向分化潜能的干细胞，能在体外向成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞等多种组织细胞分化，使其有望应用于临床组织修复。此外，MSCs能够抑制T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、DCs的增殖及功能[1]，提示MSCs有望用于预防移植物抗宿主病(graftversus-host disease,GVHD），提高器官移植的成功率。目前能够从脐血、肌肉、软骨等骨髓外组织中成功分离MSCs，但是数量相对较少。胎盘作为MSCs的来源容易获取，不涉及伦理学问题，且胎盘MSCs的细胞表型及免疫功能均与骨髓MSCs相似[2]，成为MSCs的理想来源。研究表明，MSCs经血管全身输注后，能穿过血管内皮细胞向靶组织迁移。在此过程中MSCs表达的黏附分子[3]、趋化因子[4]、生长因子[5]以及蛋白酶参与介导了MSCs的黏附和迁移。此外，MSCs亦表达负性共刺激分子，如PD-L1[6]、B7H4[7]，但其生物学功能尚不清楚。

PD-L2与PD-L1同为PD-1（programmed death-1）的配体，通过PD-1/PD-Ls途径作用于T淋巴细胞，抑制T淋巴细胞的增殖以及对细胞因子的分泌，在调节免疫应答的过程中发挥重要作用[8]。目前，对于PD-L2在hPMSCs上的表达情况，以及其在hPMSCs的黏附、迁移和免疫功能中的作用尚不清楚。鉴于此，本研究采用化学合成的siRNA阻断PD-L2的基因表达，探讨其在hPMSCs的黏附和迁移过程中的生物学意义。现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1材料低糖DMEM培养基（DMEM-LG）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Hyclone公司，Ⅳ型胶原酶为美国Gibco公司产品，PE或FITC标记的鼠抗人CD34、CD4、CD8、CD14、CD25、CD44、CD45、CD69、CD105、CD166单克隆抗体购自美国Sigma公司，PD-L2 siRNA、脂质体转染试剂LipofectamineTM2000购自南通百奥迈科公司，Trizol为上海生工生物产品，RT-PCR试剂盒购自加拿大Fermentas公司。

1.2方法

1.2.1 hPMSCs分离、培养和鉴定胎盘组织来自健康足月产妇，供者知情同意。参考相关文献[3]进行hPMSCs分离培养，将胎盘去除绒毛膜、羊膜和蜕膜组织，PBS缓冲液反复冲洗，洗净残留血液。将胎盘组织剪碎后加入1%Ⅳ型胶原酶，37℃消化30min，过100目筛、研磨、收集细胞，1500 r/min离心5min，PBS缓冲液洗涤两次，加入DMEM-LG重悬细胞，调整合适浓度后接种于6板孔，37℃、5%CO2条件下培养。3 d半量换液，去除未贴壁的悬浮细胞。之后每3～4 d更换培养基，7～8 d传代1次。据细胞形态和细胞表面抗原CD34、CD45、CD14、CD44、CD105和CD166的表达进行鉴定，3代以后的细胞用于实验。

1.2.2 RT-PCR检测hPMSCs对PD-L2的表达收集培养3代后的hPMSCs，采用Trizol法提取细胞总RNA，加入引物和逆转录酶，常规方法合成cDNA。所用引物的序列为：PD-L2上游引物：5'-GTTCCA CATACCTCA AGTCCA AGT-3'，下游引物：5'-TCC CTC ACG TGA GTA TTC CAG AAG-3'。β-actin上游引物：5'-GGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游引物：5'-GGA AGG TGG ACA GCG AGG-3'。PCR反应条件为：94℃2min，94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，28个循环，72℃10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。按2×Taq PCRMasterMix试剂盒说明书取等量cDNA进行PCR反应。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.3 siRNA转染收集第4代hPMSCs，调整合适浓度，接种于6孔板，每孔4×105个，37℃、5%CO2条件下培养24 h。按脂质体转染试剂LipofectamineTM2000说明书操作，将siRNA转染入细胞，siRNA的终浓度为40pmol/ml，继续培养6 h用倒置显微镜观察荧光表达，FCM检测转染效率，转染后48 h RTPCR检测PD-L2的表达。

1.2.4 hPMSCs的黏附能力检测转染后48 h，收集细胞，调整细胞密度至1×105/mL，接种于24孔板。实验分组为接种后0.5 h、1 h和3 h三个培养时间段，每个时间段分别设PD-L2阻断组和正常对照组。分别于接种后0.5 h、1 h、3 h收集板孔中未贴壁细胞，入流式管，1000 r/min离心5 min，弃上清，各加入500μL固定液，轻轻混匀后流式细胞仪计数。

1.2.5 hPMSCs的迁移能力检测转染后48 h，收集细胞，DMEM-LG重悬细胞，接种于Transwell板上室，每室1×105个细胞、100μL DMEM-LG；Transwell板下室分别加入600μL DMEM-LG、含SDF-1α(10ng/ mL)的DMEM-LG、hPMSCs正常培养上清。37℃、5% CO2条件下培养。实验分组为DMEM-LG组、含SDF-1α的DMEM-LG组、hPMSCs培养上清组，三种培养条件组分别设PD-L2阻断组和正常对照组。培养4 h后观察并收集Transwell板各孔下室中细胞，1000 r/ min离心5min，加入固定液(每管500μL)悬起细胞，流式细胞仪计数。

1.3统计学处理采用SPAA13.0统计软件分析，数据以±s表示，两组均数比较采用t检验。

2结果

2.1 hPMSCs的鉴定结果原代分离培养3 d后，镜下可见单个生长的细胞，1周后形成散在的梭形贴壁细胞克隆(图1-ⅠA)，培养两周时，贴壁细胞克隆明显增多，可见成簇的成纤维状细胞生长(图1-ⅠB)，至4周时，大量增殖的细胞密布整个板底（图1-ⅠC）。培养3代之后的细胞呈规则长梭形，均匀贴壁生长(图1-ⅠD)。细胞表面标志为CD44+、CD105+、CD166+、CD14-、CD34-和CD45-(图1-Ⅱ)，与文献[9]报道一致。

图1 h PMSCs的形态及表型特征

2.2 hPMSCs对PD-L2的表达siRNA转染后24 h，RT-PCR检测结果表明，PD-L2高表达于hPMSCs（图2）。

图2：hPMSCs高表达PD-L2

图3：siRNA的转染效率及转染后24 h RT-PCR检测PD-L2在hPMSCs上的表达(Ⅰ)：siRNA转染后6 FAM检测转染效率；(Ⅱ)：a：PD-L2正常对照组；b：PD-L2阻断组；

2.3 siRNA转染结果荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光表达。转染效率为80.24%（图3-Ⅰ）。化学合成的siRNA能有效阻断PD-L2的基因表达(图3-Ⅱ)。

2.4阻断PD-L2的表达后hPMSCs的黏附能力的影响黏附率检测显示，接种后0.5 h，阻断组细胞的黏附率与正常对照组相比无显著性差异；在接种后1 h和3 h，阻断组细胞的黏附率明显高于正常对照组（P＜0.05）（图4）。表明共刺激分子PD-L2在hPMSCs的黏附过程中发挥重要作用。

2.5阻断PD-L2的表达后hPMSCs的迁移能力减弱Transwell检测结果表明，三种培养条件下，阻断组细胞的迁移率均显著低于正常对照组(P＜0.01)(图5)。表明共刺激分子PD-L2参与介导hPMSCs的迁移。

图4 PD-L2阻断对hPMSCs黏附能力的影响

图5：PD-L2阻断对hPMSCs迁移能力的影响

3讨论

MSCs为多潜能干细胞，能向多种组织细胞分化，且具有自我更新能力，使其有望成为修复损伤组织的良好种子细胞。MSCs能够从多种骨髓外组织中成功分离。我们从人胎盘组织中成功分离出的MSCs，具有和诸多报道中的MSCs相似的表面标志以及多向分化能力。通过脂质体转染法能将化学合成的siRNA成功转入hPMSCs，并有效阻断PD-L2的基因表达，而且转染对细胞的生长能力不产生负面影响。

研究发现，MSCs具有显著的迁移能力[6]，经全身输注后能够向多种组织发生迁移[10]。目前MSCs已用于临床治疗组织损伤，如糖尿病并发的气性坏疽。MSCs进入血流之后，首先与血管内皮细胞紧密接触，然后迁移至内皮细胞内并最终到达损伤组织[11]。研究显示，人骨髓MSCs（hBMSCs）、hPMSCs和脐血MSCs（hUCMSCs）的迁移能力存在差异。在既定条件下，hBMSCs和hPMSCs的迁移能力分别是hUCMSCs的5.9倍和3.2倍[12]。MSCs表达的多种蛋白参与介导其迁移，如组织蛋白酶B、D能增强hUCMSCs的迁移能力。而纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)参与抑制hUCMSCs的迁移。Brooke等[13]人研究发现，hBMSCs和hPMSCs均在mRNA水平上表达CD54（ICAM-1）、E-cadherin、CD166（ALCAM）、CD56（NCAM）、CD106（VCAM-1）等分子。此外，CCR7、CCR8、CCR10、CCR11、CXCR4和CXCR6亦表达于hBMSCs和hPMSCs。这些分子在hBMSCs和hPMSCs黏附和迁移过程中发挥重要作用。

本研究结果表明，hPMSCs高表达PD-L2，阻断PD-L2的表达后，hPMSCs的黏附能力增强。提示PD-L2参与调节hPMSCs的黏附。在hPMSCs的迁移方面，不同培养条件下，hPMSCs的迁移能力存在明显的差异，hPMSCs培养上清组中hPMSCs的迁移率高于DMEM组、含SDF-1α的DMEM组，可能因为hPMSCs培养上清中含有hPMSCs迁移所必需的多种细胞因子，如CCR1、CCR8、CCR11和CCR6的相应配体。阻断PD-L2在hPMSCs上的表达后，各培养组细胞的迁移率均显著降低，表明PD-L2参与介导了hPMSCs的迁移。

为了探讨PD-L2影响hPMSCs迁移的可能机制，我们观察了SDF-1α的存在对hPMSCs的迁移有何影响。结果显示，SDF-1α组hPMSCs的迁移数量多于DMEM组细胞，阻断PD-L2的表达后，hPMSCs的迁移率显著降低。这表明，hPMSCs在CXCR4的配体SDF-1α的作用下发生了定向迁移，而且PDL2的阻断对hPMSCs沿SDF-1α/CXCR-4轴向迁移产生重要影响，但其中具体的机制有待深入研究。

综上所述，hPMSCs高表达共刺激分子PD-L2，通过siRNA阻断PD-L2的基因表达后，hPMSCs的黏附力增强迁移力明显减弱。说明PD-L2作为PD-1的受体对于hPMSCs的黏附和迁移具有重要意义。为hPMSCs的负性调节机制的研究以及临床应用提供理论依据。

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PD-Betw een L2 In Hum an Placen ta M esenchym al Stem Cells On The Exp ression And Its Biological Significance

Zhang Siying,Zhang Jialun
(Hezemedicalcollege,Heze 274500,Shandong)

ObjectiveDiscussed the PD-between L2 in human placentamesenchymalstem celladhesion andmigration in the process of biological significance.MethodsThe digestion method between placentamesenchymal stem cellswere isolated and cultured,in vitro amplification culture after three generationsused in experiments.RT-PCR detection of PD-between L2 in human placentamesenchymal stem cellson the expression of application of chemical synthesis of PD-L2 siRNA blocking between PD-L2 in human placentamesenchymal stem cells on the expression of Cell countingmethod to detecthuman placentaadhesion ability ofmesenchymalstem cells.Transwellmethod to detecthuman placentamesenchymal stem cells'ability to m igrate.ResultsThe placentalmesenchymal stem cells between high expression PD-L2molecules,PD-L2 siRNA can effectively block between placentamesenchymal stem cells in PD-the expression of L2.Cell count,according to the resultsof vaccination after 0.5 h block group between placenta adhesion rate ofmesenchymalstem cells compared w ith normal controlgroup no significantincreases,in the 1 h and 3 h after inoculation,blocking group between placenta adhesion rate of mesenchymal stem cellswere significantly higher than normal control group; Transwell test results showed that compared w ith normal control group,in DMEM-LG,DMEM containing alpha SDF-1-LG,people between the placentamesenchymal stem cell culture supernatantof three conditions,cellmobility of blocking group were significantly reduced.ConclusionThe PD-between L2 expression in human placenta mesenchymal stem cells,and between the peopleof the placentaadhesion andmigration of mesenchymalstem cellsplay an important role.

human placentamesenchymalstem cells;PD-L2;Adhesion;the migration

R392.2

：A

：1008-4118（2013）02

10.3969/j.issn.1008-4118.2013.02.

2013-05-08