薏苡仁淀粉酶改性多孔化关键工艺优化

吕 峰 傅新征 李宇翔

（福建农林大学食品科学学院1，福州 350002）

（武夷学院茶与食品学院2，武夷山 354300）

多孔淀粉（Porous Starch），又称微孔淀粉（Microporous starch），是一种新型的功能性改性淀粉，是淀粉在低于糊化温度的条件下，受到具有生淀粉酶活力的酶作用而形成的多孔性蜂窝状中空颗粒［1－2］，具有良好的吸附性，可以包埋各种物质于其中，是一种高科技含量的新型微胶囊化包埋壁材，可以广泛用于医药、农药、印刷、日用化工、化妆品和食品行业［3－4］。

薏苡仁是我国传统的药食同源的食物，具有较高的营养价值和独特的药用价值。目前国内外对薏苡仁的开发利用极为重视，特别是对其功能成分和药理活性的研究已成为热点［5－7］。

薏苡仁酯已被国内外医学界成功地提取、开发成临床上的抗肿瘤、抗癌的药物；其加工副产物——脱脂薏苡仁的综合利用则成为人们关注的研究对象。淀粉作为薏苡仁中的主要碳水化合物［8］，是可利用的良好食物资源。

本研究以提取功能成分后的副产物——脱酯薏苡仁为原料，酶法制备薏苡仁淀粉，并采用糖化酶对后者进行多孔化改性修饰。基于单因素试验，通过二次回归旋转组合试验设计，分别建立糖化酶用量、酶改性时间及酶改性温度与薏苡仁多孔淀粉的吸水率和吸油率的数学回归方程，探讨、优化薏苡仁淀粉多孔化的关键工艺参数，旨在提升薏苡仁的综合开发利用水平，提高其经济附加值，为促进我国多孔淀粉的产业化生产提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试验材料

薏苡仁淀粉：以脱脂后的浦城官路山薏苡仁为原料（福建省浦城县薏苡协会提供），实验室酶法自制。

糖化酶（50 000 u）：无锡市雪梅酶制剂科技有限公司。

氢氧化钠（NaOH）、柠檬酸（C6H8O7）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）：均为分析纯（AR），国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

JYL－BO11型九阳料理机：山东九阳股份有限公司；HH－4型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；TE15025赛多利斯电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DHG－9240A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；SC－3612低速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司。

1.2 试验方法

1.2.1 薏苡仁多孔淀粉制备方法

称取定量薏苡仁淀粉，按比例加入一定pH的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，充分搅拌使淀粉颗粒均匀分散于溶液中，另将定量的糖化酶亦预先溶解在相同pH的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液中活化30min左右，二者混合，于恒温振荡条件下计时反应。结束时立即加入2 mL 4%的NaOH溶液，中止酶促反应。将反应液以3 000 r／min离心10 min，收集沉淀，反复洗涤、离心至中性，置于45℃热风干燥至水分含量为10%左右，冷却、粉碎，过150目筛，得薏苡仁多孔淀粉样品。

1.2.2 薏苡仁淀粉多孔化酶改性工艺优化

单因素试验结果表明，在薏苡仁多孔淀粉的制备过程中，影响其吸水率和吸油率的重要因素包括：糖化酶用量、酶改性温度，酶改性时间、酶解液pH等；它们的适宜参数为：糖化酶用量500 u／mL左右、酶改性时间16 h左右、酶改性温度55～60℃、酶解液pH 4.0左右。基于单因素试验，采用二次回归旋转组合设计方案实施试验，分别建立糖化酶用量（X1）、酶改性时间（X2）、酶改性温度（X3）与薏苡仁多孔淀粉吸水率（Y1）和吸油率（Y2）的数学回归模型，并优化薏苡仁淀粉多孔化酶改性关键工艺参数。薏苡仁淀粉多孔化酶改性二次回归旋转组合试验设计方案的因素与水平设计见表1。

表1 薏苡仁淀粉的多孔化酶改性二次回归旋转组合试验因素水平表

1.3 指标检测与方法

吸水率和吸油率是衡量多孔淀粉吸附性能的重要指标。薏苡仁多孔淀粉的吸水率和吸油率测定参考丁晓雯等［9］的测定方法。

准确称取5.0 g薏苡仁多孔淀粉，室温下与25 mL水或油混合并搅拌2 h，置于已知重量的离心瓶中，3 000 r／min离心10 min，离心后倒干上层清水或澄清的油，测定离心瓶及瓶中样品的总质量，按下列公式计算吸水率和吸油率：

式中：m为薏苡仁多孔淀粉质量；m1为离心瓶质量；m2为离心后离心瓶及瓶中样品的质量。

1.4 统计分析

采用DPSv3.01系统处理数据，进行单因子方差分析，考虑多因子交互作用，并进行F显著性检验。

2 结果与分析

2.1 方程回归及方差分析

用软件系统对表2中两个指标值进行处理分析，分别得到薏苡仁多孔淀粉的吸水率（Y1）、吸油率（Y2）与糖化酶用量（X1）、酶改性时间（X2）和酶改性温度（X3）的数学回归方程，并剔除在α＝0.05显著水平的不显著系数项后，得到简化回归方程（1）、（2）：

表2 薏苡仁淀粉多孔化的酶改性工艺二次回归旋转组合设计及试验结果

式中自变量取各代码值，因变量取计算值，由回归方程（1）、（2）可计算出薏苡仁多孔淀粉吸水率Y1、吸油率Y2的值，为进一步确定各因素对薏苡仁多孔淀粉吸水率Y1和吸油率Y2的影响程度，用方差分析对所得方程的显著性和回归拟合性进行检验，结果见表3、表4。

表3 薏苡仁多孔淀粉的吸水率方差分析

表4 薏苡仁多孔淀粉的吸油率方差分析

表3、表4对回归方程（1）、（2）的F检验和失拟检验的结果表明：回归项均在0.01水平上呈极显著（P＜0.01），而失拟项均不显著（P＞0.05），说明本试验得到的两个回归方程拟合程度较好，能够与实际情况拟合，分别可以用来反映糖化酶用量X1、酶改性时间X2及酶改性温度X3对薏苡仁多孔淀粉的吸水率Y1与吸油率Y2的影响关系。

2.2 试验因子对薏苡仁多孔淀粉的吸水率和吸油率的影响趋势

2.2.1 单因子效应分析

对回归方程（1）、（2）进行降维分析，将糖化酶用量X1、酶改性时间X2及酶改性温度X33因素中的2个分别固定在零水平，观察各单因素在不同水平上对薏苡仁多孔淀粉的吸水率和吸油率的影响效应，得到以其中一个因素为决策变量的偏子回归方程图1和图2。

图1 各因素与薏苡仁多孔淀粉吸水率的关系

由图1可看出，3因素对薏苡仁多孔淀粉吸水率的关系曲线均呈类似抛物线状，其影响显著性为：酶改性温度的影响最显著，其次是酶改性时间和糖化酶用量。设其他两因素为零水平时，随酶改性温度的升高，薏苡仁多孔淀粉样品的吸水率呈明显上升趋势，当酶改性温度达到1水平（58℃）时，样品的吸水率达到最大值，128.20%；之后呈平缓且略有下降趋势。

由酶改性时间、糖化酶用量与薏苡仁多孔淀粉吸水率的两关系曲线可知，当糖化酶用量与酶改性时间均为0水平（500 u／mL、16 h）时，薏苡仁多孔淀粉样品吸水率均为最高，126.00%；但随两因素逐渐偏离0水平，薏苡仁多孔淀粉样品的吸水率均呈下降趋势。

图2 各因素与薏苡仁多孔淀粉吸油率的关系

由图2可知，各因素对薏苡仁多孔淀粉吸油率的影响顺序从大到小为：糖化酶用量＞酶改性温度＞酶改性时间。糖化酶用量对薏苡仁多孔淀粉吸油率的影响趋势是先升高后降低，当糖化酶用量在0水平（500 u／mL）时，样品的吸油率为最高（78.14%）。酶改性温度在 －1.628水平（50℃）至1水平（58℃）范围内，薏苡仁多孔淀粉的吸油率逐渐增至最高（79.30%）后，样品的吸油率趋平缓。随酶改性时间的延长，薏苡仁多孔淀粉吸油率逐渐增大，当酶改性时间为0水平（16 h）时样品的吸油率达到峰值，为78.14%，0水平后则呈现下降趋势。

2.2.2 因素间相互效应分析

图3a响应面显示，当两因素在 －1.682（400 u／mL、50℃）至 0（500 u／mL、55℃）水平范围内，对薏苡仁多孔淀粉吸水率的影响有明显的正相关关系，而在0至1.682（600 u／mL、60℃）水平范围，对薏苡仁多孔淀粉吸水率的影响则呈负相关关系；当两因素均处于0水平时，薏苡仁多孔淀粉的吸水率达到最大值126.00%；由图3b可知，等高线呈椭圆形，表明糖化酶用量（X1）和酶改性时间（X2）的交互作用对薏苡仁多孔淀粉的吸水率Y1有显著的影响（P＜0.05）。

图3 糖化酶用量和酶改性时间对薏苡仁多孔淀粉吸水率的影响

图4 糖化酶用量和酶改性温度对薏苡仁多孔淀粉吸水率的影响

由图4可知，糖化酶用量（X1）和酶改性时间（X3）对薏苡仁多孔淀粉的吸水率（Y1）有显著的交互影响作用（P＜0.05）；由4b图可知，等高线呈先密后疏的变化趋势，结合图4a响应面图表明，当糖化酶用量在小于0水平（500 u／mL）及酶改性温度为1水平（58℃）的范围内，两因素对薏苡仁多孔淀粉吸水率的影响具有较强的正相关交互关系，而当两因素分别大于上述两水平时，则对薏苡仁多孔淀粉吸水率的影响具有微弱的负相关交互关系。

图5 糖化酶用量和酶改性时间对薏苡仁多孔淀粉吸油率的影响

回归方程（2）及图5表明，糖化酶用量（X1）和酶改性时间（X2）之间的交互作用对薏苡仁多孔淀粉吸油率Y2有极显著的影响（P＜0．01）。在 －1.682（400 u／mL、12 h）至0（500 u／mL、16 h）水平范围内，两因素对薏苡仁多孔淀粉吸油率的影响呈现极显著的正交互作用；而高于0水平后，两因子则对薏苡仁多孔淀粉吸油率的影响具有极显著的负交互作用，提示糖化酶用量和酶改性时间过低或过高时，都将导致薏苡仁多孔淀粉吸油率的显著降低。

图6显示，糖化酶用量（X1）和酶改性温度（X3）的交互项对薏苡仁多孔淀粉的吸油率（Y2）亦影响显著（P＜0．05）。在糖化酶用量和酶改性温度都为－1.628水平（400 u／mL和50℃）时，薏苡仁多孔淀粉的吸油率最低，仅为62.92%；随着糖化酶用量的增加和酶改性温度的升高，薏苡仁多孔淀粉的吸油率逐渐提高，当糖化酶用量为0水平（500u／mL）、酶改性温度为1水平（58℃）时，薏苡仁多孔淀粉的吸油率达到最大，79.30%；随后样品的吸油率缓慢降低，提示糖化酶用量和酶改性温度分别处于0水平与1水平范围内，二者对薏苡仁多孔淀粉吸油率的影响呈显著正交互作用；反之则呈负交互作用。

图6 糖化酶用量和酶改性温度对薏苡仁多孔淀粉吸油率的影响

2.3 酶改性制备薏苡仁多孔淀粉工艺参数的优化

经DPS v3.01计算，在本试验条件下，获得薏苡仁多孔淀粉样品的吸水率（Y1）和吸油率（Y2）最大值的优化工艺参数组合均为：X1＝0.000、X2＝0.000、X3＝1.000，即糖化酶用量为 500 u／mL、酶改性时间为16 h、酶改性温度为58℃，所得薏苡仁多孔淀粉样品的吸水率最大值为128.20%、吸油率最大值为79.30%。

2.4 验证试验

以优化的薏苡仁淀粉多孔化酶改性关键工艺参数组合为条件（即糖化酶用量为500 u／mL、酶改性时间为16 h、酶改性温度为58℃），进行扩大性验证试验，试验重复3次，得到的薏苡仁多孔淀粉样品的平均吸水率为129.01%、平均吸油率为79.87%，与理想条件下的试验值误差分别为0.81%、0.57%，其差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论与结论

影响酶改性制备多孔淀粉的因素主要有酶解温度、酶用量、酶改性时间、酶解液pH等［14］，它们常成为酶法制备多孔淀粉的主要研究内容。

本研究认为，糖化酶是实现薏苡仁淀粉微孔修饰的物质基础，其量不足或过多，均可导致薏苡仁多孔淀粉吸水率和吸油率的降低。产生这种变化趋势的原因主要是当薏苡仁淀粉的质量固定后，随着糖化酶用量的增加，反应液中的酶浓度逐渐增大，相应被改性修饰的薏苡仁淀粉颗粒数和各颗粒被酶结合的位点都增多，故薏苡仁多孔淀粉的吸附性能逐渐提高；当几乎全部的薏苡仁淀粉颗粒均被改性修饰且各颗粒被酶结合的位点数增加到适量时，薏苡仁多孔淀粉的吸附性能达到最佳；若此时再继续增加酶的使用量，薏苡仁淀粉颗粒被酶结合的位点过多，即微孔数过多，则导致临近的微孔相通而结构破损，无法锁住水分或油，吸附性能下降。

作研究酶促反应，酶解温度与糖化酶的活性密切相关，只有当酶解温度与糖化酶的最适温度相吻合时，薏苡仁淀粉的微孔修饰才能顺利进行；而高于或低于糖化酶的最适温度，均可因为糖化酶的活力受到抑制，而影响薏苡仁淀粉的微孔修饰。

酶改性时间直接决定薏苡仁淀粉微孔的修饰程度。这是因为在一定酶改性时间范围内，薏苡仁淀粉被糖化酶适当地改性修饰，形成具有许多微孔疏松结构的淀粉颗粒，使吸附性能明显提高；但如果酶改性时间过长，薏苡仁淀粉被水解修饰过度，其颗粒内部空间的孔洞结构遭到破坏而无法较好的将水分或油锁住，将导致其样品的吸水率和吸油率下降。

本试验以实验室酶法自制的薏苡仁淀粉为原料，采用糖化酶对薏苡仁淀粉进行多孔化酶改性修饰，并通过二次回归旋转组合试验设计，分别建立了糖化酶用量（X1）、酶改性时间（X2）和酶改性温度（X3）与薏苡仁多孔淀粉吸水率（Y1）、吸油率（Y2）的数学回归方程：

经DPSv3.01系统处理，优化得到薏苡仁淀粉多孔化酶改性的关键工艺参数组合为：糖化酶用量为500 u／mL、酶改性时间为16 h、酶改性温度为58℃，以此条件并结合单因素试验所得其他影响因素的适宜参数制备薏苡仁多孔淀粉，得到样品其吸水率129.01%、吸油率79.87%，吸附包埋性能优良。

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